虾过敏原蛋白纯化中硫酸铵沉淀法的改进
摘要：目的优化虾过敏原蛋白纯化的硫酸铵沉淀工艺，提高纯化效果。方法测定不同饱和度硫酸铵溶液的体积和pH，将过敏原蛋白粉末加入固定饱和度和pH的硫酸铵溶液中沉淀，并用SDS-PAGE方法检测不同硫酸铵浓度下蛋白质组分的变化。结果PH7.5的30 %饱和度硫酸铵溶液可有效地分离虾过敏原蛋白，进一步柱层析得到只有一条电泳带的样品。结论通过改进硫酸铵沉淀工艺，可提高虾过敏原蛋白的纯化效果。
关键词：虾；过敏原；纯化；硫酸铵沉淀
中图分类号：R985.2文献标识码：A文章编号：1672-979x(2008)11-0050-03
Improvement of Shrimp (Penaeus vannamei) Allergens Purification by Ammonium Sulfate Precipitation
ZHANG Yi-qun1, LIN Hong*1, LI Zhen-xing1, LV Peng2
, 百拇医药
(1. Seafood Safety Lab, College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Shandong Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau, Qingdao 266001, China)
Abstract：Objective To optimize the purification technology of shrimp allergens by ammonium sulfate precipitation and enhance the purification efficiency. Methods The volume and pH value of ammonium sulfate solutions with different saturation were measured. The changes of protein compositions in different solutions were determined by SDS-PAGE after adding the protein allergens powder to ammonium sulfate solutions with different pH value and concentration. Results 30 % saturation ammonium sulfate solution with pH 7.5 could deposit shrimp allergens effectively. By a further gel filtration, the shrimp allergens could be obtained with only one electrophoresis band. Conclusion The purification efficiency of shrimp allergens can be enhanced by improving the precipitation technology of ammonium sulfate.
, 百拇医药
Key words：shrimp; allergen; purification; ammonium sulfate precipitation
近年，过敏疾病正成为一种常见、多发病。流行病学研究显示[1]，约33 %的过敏反应由食物诱发，有时甚至造成过敏性休克，严重时可危及生命[2-4]。1999年国际食品法典委员会公布的常见致敏食品清单中，虾类及其制品是主要的过敏食物之一[5]。过敏原性质的研究、生物体内化学变化过程的实验室再现以及多种抗体的制备，要求纯度较高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分对研究加工方式对过敏原活性的影响，开发能降低海产品过敏原的食品加工技术具有重要的意义。纯化过敏原还可在临床上明确过敏原类型，提高过敏症诊断的灵敏度。
研究表明，虾过敏原是一种相对分子质量约36×103的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白[6]。传统的纯化方法主要是用60 %饱和度硫酸铵沉淀，再经过凝胶柱层析、离子交换层析等一系列纯化步骤，方法繁琐。本课题组在研究中改进了传统的方法，获得了较好的结果，提高了纯化率。现以南美白对虾为例，介绍改进后的虾过敏原纯化法，为进一步研究虾过敏原的性质提供物质基础。
, 百拇医药
1材料与仪器
1.1材料
南美白对虾(Penaeus vannamei，购自青岛南山水产品市场，鲜活品)；优级纯硫酸铵(天津科密欧化学试剂开发中心)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，生化试剂，青岛福林生物化学公司)；十二烷基硫酸钠(SDS，生化试剂，山东爱博科技贸易公司)。其余试剂为分析纯。
1.2仪器
DYY-7C 型电泳仪(北京六一仪器厂)；Tanon-3500R 型凝胶成像及分析系统(上海天能科技公司)；FD1 型冷冻干燥机(丹麦Heto公司)；PHS-3C 型pH计(上海伟业仪器厂)；BR4i 型冷冻离心机(法国Jouan公司)；TU-1810 型紫外可见分光光度计(北京普析通用公司)。
2方法
, 百拇医药
2.1虾过敏原提取物的制备
参照文献[7]的方法制作含虾肉的丙酮粉。取5 g丙酮粉，加入1 mol/L KCl 40 mL，4 ℃条件下提取24 h，9 000 r/min离心15 min。取上清，将沉淀物在1 mol/L KCl溶液20 mL中重新溶解，4 ℃条件下提取4 h，然后10 000 r/min离心15 min。取上清，混合2次上清液，沸水浴加热。5 000 r/min离心后，弃上清，用0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析72 h，每12 h换1次透析液。然后冷冻干燥提取物，置-20 ℃冰箱备用。
2.2不同饱和度硫酸铵溶液的体积及pH变化
以原始体积为50 mL，10 %为单位分别配制不同饱和度(20 %～90 %)的硫酸铵溶液，测定配制前后溶液的体积及pH变化。
2.3虾过敏原的硫酸铵沉淀
, http://www.100md.com
以10 %为单位，分别配制不同饱和度(30 %～60 %)的硫酸铵溶液，调pH至7.5，然后分别取20 mL，将冻干后的虾过敏原提取物分别加入不同浓度的硫酸铵溶液中至浓度为5 mg/mL，0 ℃条件下搅拌30 min，充分沉淀后，4 ℃条件下10 000 r/min离心30 min。将上清和沉淀分别转移至透析袋中，于双蒸水中透析24 h，-20 ℃冷冻备用。
2.4虾过敏原的柱层析纯化
硫酸铵沉淀经透析后的溶液在Sephadex VG-100凝胶柱上进一步分离。缓冲液为0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.5)，流速0.5 mL/min，收集主峰。
2.5SDS-PAGE及凝胶扫描分析
用Laemmli建立的不连续电泳体系[8]，其中分离胶浓度为12 %(W/V)，堆积胶浓度为5 %(W/V)。蛋白质样品稀释为1 mg/mL并经样品缓冲液处理，加样量15 μL。电泳完毕，考马斯亮蓝R250染色，用GIS凝胶成像系统拍照、分析。, http://www.100md.com(张轶群 林 洪 李振兴 吕 朋)
关键词：虾；过敏原；纯化；硫酸铵沉淀
中图分类号：R985.2文献标识码：A文章编号：1672-979x(2008)11-0050-03
Improvement of Shrimp (Penaeus vannamei) Allergens Purification by Ammonium Sulfate Precipitation
ZHANG Yi-qun1, LIN Hong*1, LI Zhen-xing1, LV Peng2
, 百拇医药
(1. Seafood Safety Lab, College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Shandong Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau, Qingdao 266001, China)
Abstract：Objective To optimize the purification technology of shrimp allergens by ammonium sulfate precipitation and enhance the purification efficiency. Methods The volume and pH value of ammonium sulfate solutions with different saturation were measured. The changes of protein compositions in different solutions were determined by SDS-PAGE after adding the protein allergens powder to ammonium sulfate solutions with different pH value and concentration. Results 30 % saturation ammonium sulfate solution with pH 7.5 could deposit shrimp allergens effectively. By a further gel filtration, the shrimp allergens could be obtained with only one electrophoresis band. Conclusion The purification efficiency of shrimp allergens can be enhanced by improving the precipitation technology of ammonium sulfate.
, 百拇医药
Key words：shrimp; allergen; purification; ammonium sulfate precipitation
近年，过敏疾病正成为一种常见、多发病。流行病学研究显示[1]，约33 %的过敏反应由食物诱发，有时甚至造成过敏性休克，严重时可危及生命[2-4]。1999年国际食品法典委员会公布的常见致敏食品清单中，虾类及其制品是主要的过敏食物之一[5]。过敏原性质的研究、生物体内化学变化过程的实验室再现以及多种抗体的制备，要求纯度较高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分对研究加工方式对过敏原活性的影响，开发能降低海产品过敏原的食品加工技术具有重要的意义。纯化过敏原还可在临床上明确过敏原类型，提高过敏症诊断的灵敏度。
研究表明，虾过敏原是一种相对分子质量约36×103的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白[6]。传统的纯化方法主要是用60 %饱和度硫酸铵沉淀，再经过凝胶柱层析、离子交换层析等一系列纯化步骤，方法繁琐。本课题组在研究中改进了传统的方法，获得了较好的结果，提高了纯化率。现以南美白对虾为例，介绍改进后的虾过敏原纯化法，为进一步研究虾过敏原的性质提供物质基础。
, 百拇医药
1材料与仪器
1.1材料
南美白对虾(Penaeus vannamei，购自青岛南山水产品市场，鲜活品)；优级纯硫酸铵(天津科密欧化学试剂开发中心)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，生化试剂，青岛福林生物化学公司)；十二烷基硫酸钠(SDS，生化试剂，山东爱博科技贸易公司)。其余试剂为分析纯。
1.2仪器
DYY-7C 型电泳仪(北京六一仪器厂)；Tanon-3500R 型凝胶成像及分析系统(上海天能科技公司)；FD1 型冷冻干燥机(丹麦Heto公司)；PHS-3C 型pH计(上海伟业仪器厂)；BR4i 型冷冻离心机(法国Jouan公司)；TU-1810 型紫外可见分光光度计(北京普析通用公司)。
2方法
, 百拇医药
2.1虾过敏原提取物的制备
参照文献[7]的方法制作含虾肉的丙酮粉。取5 g丙酮粉，加入1 mol/L KCl 40 mL，4 ℃条件下提取24 h，9 000 r/min离心15 min。取上清，将沉淀物在1 mol/L KCl溶液20 mL中重新溶解，4 ℃条件下提取4 h，然后10 000 r/min离心15 min。取上清，混合2次上清液，沸水浴加热。5 000 r/min离心后，弃上清，用0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析72 h，每12 h换1次透析液。然后冷冻干燥提取物，置-20 ℃冰箱备用。
2.2不同饱和度硫酸铵溶液的体积及pH变化
以原始体积为50 mL，10 %为单位分别配制不同饱和度(20 %～90 %)的硫酸铵溶液，测定配制前后溶液的体积及pH变化。
2.3虾过敏原的硫酸铵沉淀
, http://www.100md.com
以10 %为单位，分别配制不同饱和度(30 %～60 %)的硫酸铵溶液，调pH至7.5，然后分别取20 mL，将冻干后的虾过敏原提取物分别加入不同浓度的硫酸铵溶液中至浓度为5 mg/mL，0 ℃条件下搅拌30 min，充分沉淀后，4 ℃条件下10 000 r/min离心30 min。将上清和沉淀分别转移至透析袋中，于双蒸水中透析24 h，-20 ℃冷冻备用。
2.4虾过敏原的柱层析纯化
硫酸铵沉淀经透析后的溶液在Sephadex VG-100凝胶柱上进一步分离。缓冲液为0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.5)，流速0.5 mL/min，收集主峰。
2.5SDS-PAGE及凝胶扫描分析
用Laemmli建立的不连续电泳体系[8]，其中分离胶浓度为12 %(W/V)，堆积胶浓度为5 %(W/V)。蛋白质样品稀释为1 mg/mL并经样品缓冲液处理，加样量15 μL。电泳完毕，考马斯亮蓝R250染色，用GIS凝胶成像系统拍照、分析。, http://www.100md.com(张轶群 林 洪 李振兴 吕 朋)