寡糖研究新进展(2)
目前分析寡糖结构的方法有(1)化学法：部分/完全酸水解、甲基化分析、Smith降解、过碘酸氧化、乙酰解、甲醇解、三氧化铬氧化等；(2)物理法：核磁共振、质谱等；(3)生物学法：主要用于酶解产物的分析。
4.1化学方法
水解生物大分子成为易测定的短链片段，从而推导出寡糖糖链的结构。控制酸的浓度、温度、时间等可以实现寡糖的部分和完全水解。在薄层板上展开水解的寡糖，对照已知的单糖，可以确定寡糖的单糖成分组成。得知单糖组成后，用甲基化反应确定单糖连接顺序及连接位置。糖分子中的游离羟基通过甲基化反应全部被甲基取代得到甲基化寡糖，水解后得到甲基化单糖。气相色谱提供的寡糖大部分结构信息，都是通过分离鉴定寡糖的甲基化水解产物完成的。目前采用最广泛的是Hakomori法，一般反应一次即可实现完全甲基化。通过高碘酸反应测定高碘酸消耗量和甲酸释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度等信息；通过Smith降解，用过碘酸盐氧化糖链，以NaBH4还原后用弱酸部分水解，生成具有特征性糖连接的重复单元，获得更多的结构信息。
, http://www.100md.com
4.2物理方法
4.2.1质谱目前质谱是化合物结构推导、确定、定性定量的主要方法，具有高灵敏度和专属性，对测定试样量的要求越来越低[17]。常用的质谱有(1)电喷雾电离质谱，将试样中分子转变成气相离子，产生的离子碎片化反应因异构体不同而有所差异，因此，寡糖及其缀合物在过碘酸氧化、还原、甲基化前后用电喷雾电离质谱和碰撞诱导分解联用技术可获得不同的碎片离子，由此可获知pmol级的寡糖及其缀合物的相对分子质量、序列、分支和连接信息；(2)快原子轰击质谱，实现了极性强、不挥发以及热不稳定的化合物不经衍生化就可直接分析，Seidel等[18]分析了从灰闭鳞番荔枝树皮中得到的2个新寡糖组分；(3)基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱，产生的分子离子十分稳定，不易裂解，对测定天然混合物中非衍生化寡糖的分子量分布格外有用；现常以2，5二羟基苯甲酸作为基质[19]。
4.2.2核磁共振使用核磁共振，糖链的各种结构特征均可在结构表征基团的微小位移变化中显示。各种2DNMR和NOE等数据对分析糖链一级结构及其溶液构象也是必不可少的。核磁共振可获得糖残基数量、糖残基组成、异头碳构型、连接位点及顺序、取代基的位置等5种结构信息。缪振春等[20]报道了一种新的测定寡糖链糖体亚谱的NMR法，该技术可克服1HNMR解析中糖环质子信号的彼此重叠，得到更完整更详细的结构信息。
, 百拇医药
4.2.3电泳用于分析寡糖结构的电泳技术主要包括[21](1)毛细管电泳不仅是有效的分离手段，还可用于分析寡糖的组成、纯度鉴定和结构归属。既可直接分析复杂寡糖，得到寡糖微观不均一性的信息，又可定性、定量分析寡糖的酶解产物，得出寡糖链的完整结构；(2)十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚偏氟乙烯薄膜电迁移技术：可以将电泳凝胶上的糖蛋白定量转移到聚偏氟乙烯薄膜上，直接酸水解后分析其氨基酸和糖基组成；也可以进行溴化氰降解、各种蛋白酶、糖肽酶和糖苷酶水解，或将膜直接置于蛋白质气相序列仪或质谱上进行序列分析，获得pmol级糖蛋白的肽链和糖链结构以及糖肽连接方式；(3)荧光基团辅助的糖电泳技术：可平行地分离和定量分析多个寡糖样品，快速灵敏，分辨率高。以荧光基团衍生化标记糖类分子的还原端羰基后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，既增强了寡糖分子的检测灵敏度，又使呈中性的糖类分子带电荷在电泳体系中分离。荧光试剂主要有8氨基萘1，3，6，三磺酸和2氨基吖啶酮，分别用于分离中性和酸性寡糖。该技术与酶解方法相结合可方便、灵敏地分析寡糖结构。常理文等[22]研究多种寡糖(如异麦芽三糖、异麦芽四糖等)经α萘胺衍生化后，用硼砂作为电泳介质的毛细管电泳行为，并对影响分离度的诸因素进行了考察。
, http://www.100md.com
4.3酶学技术[21]
糖类结构的酶学方法中，通常用糖苷酶消化寡糖以推测其化学结构。由于酶解的高度专一性和放射标记方法的引入，使得此法十分有效并广为采用。它在糖链结构研究中的作用是(1)通过顺序降解，阐明糖链的一级结构；(2)确定每个单糖的异头构型；(3)从糖复合物上切得完整的糖链。
糖苷酶可分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。外切酶只能切下非还原末端的一个单糖，对糖基组成和糖苷键有专一性要求，可通过水解逐步降解糖链，提供糖基组成、排列顺序及糖苷键的α或β异头构型的信息；内切酶可水解糖链内部的糖苷键，释放糖链片断，可从肽链上切下完整的糖链，有时还可将长的糖链切为较短的寡糖片段，以利于结构分析。
上述方法的最大缺陷是酶解结束后需要多次分离和确定产物的流体动力学体积。实际工作中可用N聚糖的试剂阵列分析法解决此问题。但由于糖蛋白上O连接糖链的高度复杂性和许多连接特异性的糖苷酶无法获得，此法目前只适用于结构规律较明确的N糖链。
, 百拇医药
4.4其他分析方法
红外光谱，X射线衍射，一维SEMDY谱和旋转坐标系NOE差谱相配合法[23]等在实际分析工作中也得到应用。此外，郑小迅等[24]以葡聚寡糖为模型分子，建立了一种以(+)MNB甲酸荧光衍生化及高效液相色谱分析为基础新的寡糖链结构分析方法，可以同时获得组成单糖种类、糖链分支位点及组成单糖的D，L构型3种结构信息。
5寡糖的生物活性
5.1免疫调节抗肿瘤
作为多糖类降解后的产物，寡糖可能是多糖发挥生物学效应的一个活性片段。寡糖不仅可以通过不同途径调节、增强免疫系统功能，而且可与免疫活性细胞上的糖受体结合，促其释放细胞因子和激素，活化下游的效应细胞[25]。Yuan等[26]研究发现，红藻κ卡拉胶寡糖能显著抑制S180荷瘤小鼠体内移植瘤的生长，并增强巨噬细胞的吞噬功能，促进脾细胞形成并分泌抗体，加速淋巴细胞的增殖，提高自然杀伤细胞的活性以及白介素2和肿瘤坏死因子α的水平。
, http://www.100md.com
5.2降血糖
近期文献[25]报道，寡糖降血糖的作用机制主要有：增加胰岛β细胞分泌，提高机体胰岛素水平；保护、修复胰岛β细胞而增加血液中胰岛素的水平；抑制α葡糖苷酶活性；抑制糖异生，促进外周组织对糖的利用；抑制醛糖还原酶；调节葡糖激酶和葡糖6磷酸酶活性等。Lu等[27]利用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型研究从魔芋根提取的3个寡糖，表明其中相对分子质量为666的四糖是有效的降血糖成分，低浓度(﹤1.5mmol)时能明显降低胰岛中由STZ诱发的NO+自由基水平，同时增加胰岛素分泌。
5.3增强造血功能
近年研究表明，中药中的多糖或寡糖类有效成分对造血系统有很好的促进作用。地黄寡糖是近年地黄补血活性研究的主要对象，可增强正常小鼠和造血功能低下小鼠的骨髓造血功能。武卫红[6]使用实验血液学检测造血系统功能的常规方法，用造血祖细胞体外培养技术考察了从地黄中提取的水苏糖和甘露三糖，证明两者有促进造血的作用，且甘露三糖促进造血祖细胞增殖分化的作用强于水苏糖，其作用途径可能是促进分泌造血生长因子。
5.4其他
有些寡糖还具有保护胃肠道[28]、抗感染、抗休克、抗过敏、保护肝脏及抗过氧化等作用。金黎明等[29]研究发现，壳聚糖有抗氧化能力，对CCl4诱导的小鼠肝损伤有较好的保护作用，但不能减轻DNA的氧化性损伤。Liu等[30]实验证明，壳聚糖能有效地保护人脐静脉内皮细胞以避免H2O2诱发的应激损伤，提示了临床治疗心血管疾病的方法。, http://www.100md.com(董权锋 于荣敏)
4.1化学方法
水解生物大分子成为易测定的短链片段，从而推导出寡糖糖链的结构。控制酸的浓度、温度、时间等可以实现寡糖的部分和完全水解。在薄层板上展开水解的寡糖，对照已知的单糖，可以确定寡糖的单糖成分组成。得知单糖组成后，用甲基化反应确定单糖连接顺序及连接位置。糖分子中的游离羟基通过甲基化反应全部被甲基取代得到甲基化寡糖，水解后得到甲基化单糖。气相色谱提供的寡糖大部分结构信息，都是通过分离鉴定寡糖的甲基化水解产物完成的。目前采用最广泛的是Hakomori法，一般反应一次即可实现完全甲基化。通过高碘酸反应测定高碘酸消耗量和甲酸释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度等信息；通过Smith降解，用过碘酸盐氧化糖链，以NaBH4还原后用弱酸部分水解，生成具有特征性糖连接的重复单元，获得更多的结构信息。
, http://www.100md.com
4.2物理方法
4.2.1质谱目前质谱是化合物结构推导、确定、定性定量的主要方法，具有高灵敏度和专属性，对测定试样量的要求越来越低[17]。常用的质谱有(1)电喷雾电离质谱，将试样中分子转变成气相离子，产生的离子碎片化反应因异构体不同而有所差异，因此，寡糖及其缀合物在过碘酸氧化、还原、甲基化前后用电喷雾电离质谱和碰撞诱导分解联用技术可获得不同的碎片离子，由此可获知pmol级的寡糖及其缀合物的相对分子质量、序列、分支和连接信息；(2)快原子轰击质谱，实现了极性强、不挥发以及热不稳定的化合物不经衍生化就可直接分析，Seidel等[18]分析了从灰闭鳞番荔枝树皮中得到的2个新寡糖组分；(3)基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱，产生的分子离子十分稳定，不易裂解，对测定天然混合物中非衍生化寡糖的分子量分布格外有用；现常以2，5二羟基苯甲酸作为基质[19]。
4.2.2核磁共振使用核磁共振，糖链的各种结构特征均可在结构表征基团的微小位移变化中显示。各种2DNMR和NOE等数据对分析糖链一级结构及其溶液构象也是必不可少的。核磁共振可获得糖残基数量、糖残基组成、异头碳构型、连接位点及顺序、取代基的位置等5种结构信息。缪振春等[20]报道了一种新的测定寡糖链糖体亚谱的NMR法，该技术可克服1HNMR解析中糖环质子信号的彼此重叠，得到更完整更详细的结构信息。
, 百拇医药
4.2.3电泳用于分析寡糖结构的电泳技术主要包括[21](1)毛细管电泳不仅是有效的分离手段，还可用于分析寡糖的组成、纯度鉴定和结构归属。既可直接分析复杂寡糖，得到寡糖微观不均一性的信息，又可定性、定量分析寡糖的酶解产物，得出寡糖链的完整结构；(2)十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚偏氟乙烯薄膜电迁移技术：可以将电泳凝胶上的糖蛋白定量转移到聚偏氟乙烯薄膜上，直接酸水解后分析其氨基酸和糖基组成；也可以进行溴化氰降解、各种蛋白酶、糖肽酶和糖苷酶水解，或将膜直接置于蛋白质气相序列仪或质谱上进行序列分析，获得pmol级糖蛋白的肽链和糖链结构以及糖肽连接方式；(3)荧光基团辅助的糖电泳技术：可平行地分离和定量分析多个寡糖样品，快速灵敏，分辨率高。以荧光基团衍生化标记糖类分子的还原端羰基后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，既增强了寡糖分子的检测灵敏度，又使呈中性的糖类分子带电荷在电泳体系中分离。荧光试剂主要有8氨基萘1，3，6，三磺酸和2氨基吖啶酮，分别用于分离中性和酸性寡糖。该技术与酶解方法相结合可方便、灵敏地分析寡糖结构。常理文等[22]研究多种寡糖(如异麦芽三糖、异麦芽四糖等)经α萘胺衍生化后，用硼砂作为电泳介质的毛细管电泳行为，并对影响分离度的诸因素进行了考察。
, http://www.100md.com
4.3酶学技术[21]
糖类结构的酶学方法中，通常用糖苷酶消化寡糖以推测其化学结构。由于酶解的高度专一性和放射标记方法的引入，使得此法十分有效并广为采用。它在糖链结构研究中的作用是(1)通过顺序降解，阐明糖链的一级结构；(2)确定每个单糖的异头构型；(3)从糖复合物上切得完整的糖链。
糖苷酶可分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。外切酶只能切下非还原末端的一个单糖，对糖基组成和糖苷键有专一性要求，可通过水解逐步降解糖链，提供糖基组成、排列顺序及糖苷键的α或β异头构型的信息；内切酶可水解糖链内部的糖苷键，释放糖链片断，可从肽链上切下完整的糖链，有时还可将长的糖链切为较短的寡糖片段，以利于结构分析。
上述方法的最大缺陷是酶解结束后需要多次分离和确定产物的流体动力学体积。实际工作中可用N聚糖的试剂阵列分析法解决此问题。但由于糖蛋白上O连接糖链的高度复杂性和许多连接特异性的糖苷酶无法获得，此法目前只适用于结构规律较明确的N糖链。
, 百拇医药
4.4其他分析方法
红外光谱，X射线衍射，一维SEMDY谱和旋转坐标系NOE差谱相配合法[23]等在实际分析工作中也得到应用。此外，郑小迅等[24]以葡聚寡糖为模型分子，建立了一种以(+)MNB甲酸荧光衍生化及高效液相色谱分析为基础新的寡糖链结构分析方法，可以同时获得组成单糖种类、糖链分支位点及组成单糖的D，L构型3种结构信息。
5寡糖的生物活性
5.1免疫调节抗肿瘤
作为多糖类降解后的产物，寡糖可能是多糖发挥生物学效应的一个活性片段。寡糖不仅可以通过不同途径调节、增强免疫系统功能，而且可与免疫活性细胞上的糖受体结合，促其释放细胞因子和激素，活化下游的效应细胞[25]。Yuan等[26]研究发现，红藻κ卡拉胶寡糖能显著抑制S180荷瘤小鼠体内移植瘤的生长，并增强巨噬细胞的吞噬功能，促进脾细胞形成并分泌抗体，加速淋巴细胞的增殖，提高自然杀伤细胞的活性以及白介素2和肿瘤坏死因子α的水平。
, http://www.100md.com
5.2降血糖
近期文献[25]报道，寡糖降血糖的作用机制主要有：增加胰岛β细胞分泌，提高机体胰岛素水平；保护、修复胰岛β细胞而增加血液中胰岛素的水平；抑制α葡糖苷酶活性；抑制糖异生，促进外周组织对糖的利用；抑制醛糖还原酶；调节葡糖激酶和葡糖6磷酸酶活性等。Lu等[27]利用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型研究从魔芋根提取的3个寡糖，表明其中相对分子质量为666的四糖是有效的降血糖成分，低浓度(﹤1.5mmol)时能明显降低胰岛中由STZ诱发的NO+自由基水平，同时增加胰岛素分泌。
5.3增强造血功能
近年研究表明，中药中的多糖或寡糖类有效成分对造血系统有很好的促进作用。地黄寡糖是近年地黄补血活性研究的主要对象，可增强正常小鼠和造血功能低下小鼠的骨髓造血功能。武卫红[6]使用实验血液学检测造血系统功能的常规方法，用造血祖细胞体外培养技术考察了从地黄中提取的水苏糖和甘露三糖，证明两者有促进造血的作用，且甘露三糖促进造血祖细胞增殖分化的作用强于水苏糖，其作用途径可能是促进分泌造血生长因子。
5.4其他
有些寡糖还具有保护胃肠道[28]、抗感染、抗休克、抗过敏、保护肝脏及抗过氧化等作用。金黎明等[29]研究发现，壳聚糖有抗氧化能力，对CCl4诱导的小鼠肝损伤有较好的保护作用，但不能减轻DNA的氧化性损伤。Liu等[30]实验证明，壳聚糖能有效地保护人脐静脉内皮细胞以避免H2O2诱发的应激损伤，提示了临床治疗心血管疾病的方法。, http://www.100md.com(董权锋 于荣敏)