积累5-甲基四氢叶酸双抗突变株的选育及条件优化(1)
摘要：目的选育积累5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的双重药物抗性高产突变株，探讨发酵时间和温度对叶酸积累形式的影响。方法紫外线和EMS联合诱变；磺胺、甲氨蝶呤药物培养基筛选菌株；单因素实验检测发酵条件对叶酸积累形式的影响；HPLC检测叶酸含量和存在形式。结果获得稳定性良好的抗性突变株，其叶酸产量是原始菌株的2.2倍。适合5-MTHF积累的发酵时间为16 h，积累量为68.94μg干菌。结论抗性突变株能提高菌株产叶酸能力，5-MTHF含量受发酵时间影响大，而发酵温度对产物形式和产量影响不显著。
关键词：抗性突变株；5-甲基四氢叶酸；四氢叶酸：叶酸
中图分类号：Q563+.8
文献标识码：A
文章编号：1672-979X(2010)03-0082-04
5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)是生物体内叶酸循环的重要存在形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。5-MTHF能预防新生儿神经管缺陷，并具有防治阿尔茨海默病的作用。此外，由于5-MTHF对正常细胞有较高的选择性保护作用，临床上逐步代替抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂5-甲酰四氢叶酸。5-MTHF也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。欧盟于2005年底批准MTHF系列产品为安全的食品增补剂，更促进了市场对5-MTHF的需求。
目前，国内5.MTHF的研究主要集中在化学合成方面，合成方法涉及不对称中心的拆分，此过程中5-MTHF易失活，收率不理想。对酵母中叶酸的分离、分析及叶酸高产菌株的筛选已有初步研究。方尚玲等发现产朊酵母中叶酸含量高达60.54μg/g干菌。李小燕等研究了发酵液中叶酸的分离分析方法。
叶酸分子由蝶呤、对氨基苯甲酸(PABA)及谷氨酸3部分组成。从分支酸、GTP起始经过10余个酶促反应转化为四氢叶酸(THF)，THF甲基化得到5-MTHF。研究发现，编码二氢叶酸还原酶的基因folA过量表达会使叶酸产量下降，可能是二氢叶酸还原酶的催化产物THF对合成途径中的某些酶产生反馈抑制引起。酵母中叶酸的生物合成过程尚不十分明确。磺胺类作为PABA的结构类似物，在叶酸的生物合成途径中影响4步酶促反应，分别是由folK、folP、folC编码的6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶、二氢蝶酸合酶、二氢叶酸合成酶及1个尚不明确的酶促反应。甲氨蝶呤是叶酸及其衍生物的结构类似物，主要通过与二氢叶酸竞争二氢叶酸还原酶结合位点来抑制THF的量，同时也是二氢蝶酸合酶的抑制剂。酵母中的叶酸主要以THF和5-MTHF的形式存在，发酵时间和温度对其存在形式有显著影响。本实验根据叶酸形式和药物敏感性的检测选择1株红酵母RY-17为诱变出发菌，通过紫外线与EMS(乙基甲磺酸盐)联合诱变筛选得到1株磺胺药、甲氨蝶呤双重抗性突变株，其叶酸含量有显著提高。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原始菌种 产朊假丝酵母(Candida utilis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DOM-4、红酵母(Rhodotorula sp.)RY-17(本实验室保存)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母(Candida lipolyica)(微生物教研室提供)。
1.1.2 主要仪器及试剂 SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Shimadzu高效液相色谱仪(SPD检测器)；UP2200H超声清洗仪(陕西鹏展科技有限公司)；HC2518高速离心机(科大创新股份有限公司)。
THF、5-MTHF、5-甲酰四氢叶酸标准品(单谷氨酸型，分析纯，Sigma)；磺胺醋酰钠、甲氨蝶呤(分析纯，昆明科翔生物科技)；EMS(分析纯，上海贝基生物科技)；其余试剂均为市售国产或进口分析纯。
1.1.3 培养基 种子培养基和发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨10；基本培养基(g/L)：葡萄糖20，KH2PO4 1，(NH4)2SO4 1，MaSO4·7H2O 0.51筛选培养基：在基本培养基中加入甲氨蝶呤和(或)磺胺醋酰钠，使甲氨蝶呤浓度为300μg/mL，磺胺醋酰钠为7 500μg/mL。
1.2 诱变出发菌株的确定
选择常见的产朊假丝酵母、啤酒酵母、热带假丝酵母、解脂假丝酵母、红酵母作为诱变的备选菌种，HPLC检测，筛选培养基培养，分析和观察各菌株的叶酸产量、形式和药物敏感度。
1.3 双抗突变株的诱变与筛选
1.3.1 联合诱变致死率的测定
4℃同步诱导培养1h，制备菌悬液并加入4倍量pH 7.0磷酸盐缓冲液和EMS，使EMS终浓度为0.5 mol/L。分别在15W紫外灯下距离20 cm处照射5，10，20，30，40，50s。每个样品分别于30℃摇床中振荡培养10，20，30，40，50，60min后用0.3 mL 20%硫代硫酸钠终止反应。样品稀释至10-1～10-5后各取0.1mL涂布平板，30℃避光培养，计算致死率。
1.3.2 诱变处理 根据以上结果选择合适的致死率诱变条件，诱变处理菌悬液，用生理盐水稀释菌悬液至10-1～10-5，各取0.1mL涂布于双抗筛选培养基，30℃避光培养。
1.3.3 叶酸高产株的筛选 挑选诱变后在双抗筛选培养基上生长较快、菌落较大的菌株留待复筛。初筛菌株接入发酵培养基中培养，发酵液离心洗涤后，分离并检测叶酸含量，筛选高产菌株。
1.3.4 稳定性实验 诱变后的高产菌株保存于双抗筛选培养斜面，每10 d进行1次传代培养，检测突变株遗传稳定性。
1.4 叶酸的分离与检测
1.4.1 分离 发酵液离心，菌体悬浮于磷酸缓冲液(pH 7.4，含1%抗坏血酸、0.05%巯基乙醇)，超声波破碎15 min后于-4℃冰箱冷冻。取出于沸水中加热12min，冰浴中冷却至室温。717型层析柱梯度洗脱(流动相：0～0.1 mol/L KCl-磷酸缓冲液)，紫外分析仪检测，部分收集器收集。洗脱液经旋蒸浓缩后加入经过透析的新制鼠血清(50μL/mL枷样品)，37℃反应180 min，煮沸5min终止反应。冰浴冷却后离心保留上清。
1.4.2 检测 微生物检测法检测叶酸总量；HPLC检测5.MTHF，外标法定量。HPLC检测条件：Develosil ODS-MG色谱柱，流动相：乙腈：水(pH7.4 KH2PO4-NaOH)=9：91，柱温30℃，流速0.5, http://www.100md.com(阚 静 胡晓川 卞筱泓 许激扬 江春艳 沈继朵)
关键词：抗性突变株；5-甲基四氢叶酸；四氢叶酸：叶酸
中图分类号：Q563+.8
文献标识码：A
文章编号：1672-979X(2010)03-0082-04
5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)是生物体内叶酸循环的重要存在形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。5-MTHF能预防新生儿神经管缺陷，并具有防治阿尔茨海默病的作用。此外，由于5-MTHF对正常细胞有较高的选择性保护作用，临床上逐步代替抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂5-甲酰四氢叶酸。5-MTHF也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。欧盟于2005年底批准MTHF系列产品为安全的食品增补剂，更促进了市场对5-MTHF的需求。
目前，国内5.MTHF的研究主要集中在化学合成方面，合成方法涉及不对称中心的拆分，此过程中5-MTHF易失活，收率不理想。对酵母中叶酸的分离、分析及叶酸高产菌株的筛选已有初步研究。方尚玲等发现产朊酵母中叶酸含量高达60.54μg/g干菌。李小燕等研究了发酵液中叶酸的分离分析方法。
叶酸分子由蝶呤、对氨基苯甲酸(PABA)及谷氨酸3部分组成。从分支酸、GTP起始经过10余个酶促反应转化为四氢叶酸(THF)，THF甲基化得到5-MTHF。研究发现，编码二氢叶酸还原酶的基因folA过量表达会使叶酸产量下降，可能是二氢叶酸还原酶的催化产物THF对合成途径中的某些酶产生反馈抑制引起。酵母中叶酸的生物合成过程尚不十分明确。磺胺类作为PABA的结构类似物，在叶酸的生物合成途径中影响4步酶促反应，分别是由folK、folP、folC编码的6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶、二氢蝶酸合酶、二氢叶酸合成酶及1个尚不明确的酶促反应。甲氨蝶呤是叶酸及其衍生物的结构类似物，主要通过与二氢叶酸竞争二氢叶酸还原酶结合位点来抑制THF的量，同时也是二氢蝶酸合酶的抑制剂。酵母中的叶酸主要以THF和5-MTHF的形式存在，发酵时间和温度对其存在形式有显著影响。本实验根据叶酸形式和药物敏感性的检测选择1株红酵母RY-17为诱变出发菌，通过紫外线与EMS(乙基甲磺酸盐)联合诱变筛选得到1株磺胺药、甲氨蝶呤双重抗性突变株，其叶酸含量有显著提高。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原始菌种 产朊假丝酵母(Candida utilis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DOM-4、红酵母(Rhodotorula sp.)RY-17(本实验室保存)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母(Candida lipolyica)(微生物教研室提供)。
1.1.2 主要仪器及试剂 SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Shimadzu高效液相色谱仪(SPD检测器)；UP2200H超声清洗仪(陕西鹏展科技有限公司)；HC2518高速离心机(科大创新股份有限公司)。
THF、5-MTHF、5-甲酰四氢叶酸标准品(单谷氨酸型，分析纯，Sigma)；磺胺醋酰钠、甲氨蝶呤(分析纯，昆明科翔生物科技)；EMS(分析纯，上海贝基生物科技)；其余试剂均为市售国产或进口分析纯。
1.1.3 培养基 种子培养基和发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨10；基本培养基(g/L)：葡萄糖20，KH2PO4 1，(NH4)2SO4 1，MaSO4·7H2O 0.51筛选培养基：在基本培养基中加入甲氨蝶呤和(或)磺胺醋酰钠，使甲氨蝶呤浓度为300μg/mL，磺胺醋酰钠为7 500μg/mL。
1.2 诱变出发菌株的确定
选择常见的产朊假丝酵母、啤酒酵母、热带假丝酵母、解脂假丝酵母、红酵母作为诱变的备选菌种，HPLC检测，筛选培养基培养，分析和观察各菌株的叶酸产量、形式和药物敏感度。
1.3 双抗突变株的诱变与筛选
1.3.1 联合诱变致死率的测定
4℃同步诱导培养1h，制备菌悬液并加入4倍量pH 7.0磷酸盐缓冲液和EMS，使EMS终浓度为0.5 mol/L。分别在15W紫外灯下距离20 cm处照射5，10，20，30，40，50s。每个样品分别于30℃摇床中振荡培养10，20，30，40，50，60min后用0.3 mL 20%硫代硫酸钠终止反应。样品稀释至10-1～10-5后各取0.1mL涂布平板，30℃避光培养，计算致死率。
1.3.2 诱变处理 根据以上结果选择合适的致死率诱变条件，诱变处理菌悬液，用生理盐水稀释菌悬液至10-1～10-5，各取0.1mL涂布于双抗筛选培养基，30℃避光培养。
1.3.3 叶酸高产株的筛选 挑选诱变后在双抗筛选培养基上生长较快、菌落较大的菌株留待复筛。初筛菌株接入发酵培养基中培养，发酵液离心洗涤后，分离并检测叶酸含量，筛选高产菌株。
1.3.4 稳定性实验 诱变后的高产菌株保存于双抗筛选培养斜面，每10 d进行1次传代培养，检测突变株遗传稳定性。
1.4 叶酸的分离与检测
1.4.1 分离 发酵液离心，菌体悬浮于磷酸缓冲液(pH 7.4，含1%抗坏血酸、0.05%巯基乙醇)，超声波破碎15 min后于-4℃冰箱冷冻。取出于沸水中加热12min，冰浴中冷却至室温。717型层析柱梯度洗脱(流动相：0～0.1 mol/L KCl-磷酸缓冲液)，紫外分析仪检测，部分收集器收集。洗脱液经旋蒸浓缩后加入经过透析的新制鼠血清(50μL/mL枷样品)，37℃反应180 min，煮沸5min终止反应。冰浴冷却后离心保留上清。
1.4.2 检测 微生物检测法检测叶酸总量；HPLC检测5.MTHF，外标法定量。HPLC检测条件：Develosil ODS-MG色谱柱，流动相：乙腈：水(pH7.4 KH2PO4-NaOH)=9：91，柱温30℃，流速0.5, http://www.100md.com(阚 静 胡晓川 卞筱泓 许激扬 江春艳 沈继朵)