高效液相色谱法测定血浆中环磷酰胺浓度
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[摘要]目的：建立血浆中环磷酰胺浓度的高效液相色谱测定法。方法：样品经甲醇沉淀蛋白，离心后取上清液直接进样。色谱柱：Shim-pack CLC-ODS柱(150 mm ×6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(1∶1 v/v)；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm。异环磷酰胺为内标。结果：环磷酰胺最低检出量为5 mg/L，平均回收率为96.4%±2.31%。结论：本方法简易、快捷、准确，适用于临床血药监测。
[关键词]高效液相色谱法；血浆；环磷酰胺浓度
[中图分类号]R979.1 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2007)05(b)-137-02
环磷酰胺(CTX) 是氮芥类烷化剂，为常用化疗药物，广泛用于各种肿瘤的治疗。环磷酞胺经肝脏微粒体氧化酶系代谢为有抗癌活性的代谢产物而发挥作用。化疗药物一般毒性较大，治疗指数较窄，需要通过药物监测来设计个体化给药方案，从而保证患者的用药安全。以往的报道，HPLC测定法大多采用乙睛-水为流动相[1]，本实验采用甲醇-水为流动相，运用高效液相色谱法测定血浆中CTX的浓度，快捷、准确，适用于临床血药浓度监测。
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1 材料与方法
1.1 材料
高效液相色谱仪：Waters公司510型泵，991型紫外二极管阵列检测器，U6K进样阀。环磷酞胺标准品(中国药品生物制品检定所) ，异环磷酰胺(Ifo) 对照品CP级，其他试剂AR级。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件色谱柱：Shim-pack CLC-ODS柱(150 mm×6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(1∶1 v/v)；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm。
1.2.2 标准液制备CTX标准液：精密称取CTX标准品50 mg，于100 ml量瓶中，蒸馏水溶解定容，浓度为500 μg/ml。Ifo对照液：精密称取Ifo对照品5 mg于100 ml量瓶中，蒸馏水溶解定容，浓度为50 μg/ml。
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1.2.3 样品处理我院2006年11月~2007年1月期间收住院用药患者，静脉注射CTX 800 ml后1 h，取上肢静脉血2 ml离心，取血浆0.5 ml，加入甲醇溶液3 ml，振荡，离心4 000 r/min，15 min取上清液20 μl直接进样。
1.2.4 标准曲线制备取健康人血浆制备标准曲线，取健康人空白血浆8份。每份0.5 ml，分别加入CTX标准液0.2、0.5、 1.0、 2.0、 4.0、10、20 μl和Ifo对照液10 μl，再分别加入甲醇溶液，按1.2.3进行后序操作, 以CTX浓度C为横坐标，AZA与内标峰高比s为纵坐标，绘制标准曲线。
2 结果
2.1 色谱图(图1、2、3)
2.2 精密度和重现性
据标准曲线项下制备三种不同浓度样本，同一浓度样本在5 d内测定，计算日间误差。同一天5次内测定样本，计算日内误差(表1)。
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2.3 干扰试验
临床上常与CTX联合用药有环孢素A、强的松、甲基强的松龙等。分别取其标准对照品加入正常人血浆中，按1.2.3方法处理后进样，结果样品进样后10 min内未出现吸收峰，不干扰CTX的测定。
2.4 方法回收率
取健康人血浆0.5 ml分别加入三种不同量的CTX标准液及Ifo对照液10 μl，按1.2.3制备，所得溶液各测定5次(表2)。
2.5 最低检出量
按信噪比≥2计算，CTX的最低检出量分为5 μg/ml。
3 讨论
CTX是临床应用最广泛的肿瘤化疗药之一，经肝脏代谢为磷酰胺氮芥后发挥作用，但是大剂量CTX在肝脏的代谢支路常会饱和，此时，其在肝脏灭活的代谢支路会产生氯乙醛等代谢产物[2]，因此CTX达到一定量后，用量的增加不会增加疗效而只会产生更大毒副反应，故对环磷酞胺进行血药浓度监测十分必要。
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目前对CTX的药动学与药效、毒性的关系尚不十分清楚。CTX原药直接从肾脏排泄的量不超过20%，而其活性代谢产物很不稳定，故临床上常规检测其活性代谢产物较困难。已发展的检测主要非活性代谢产物氯乙醛的检测方法[3]很难确切评价CTX的药效与毒性，不过可从CTX和氯乙醛的监测推测其活化比例，以探求母体药物的药动学与药效、毒性的关系。
本实验的结果表明，CTX与内标分离良好，色谱峰型良好，不受血浆成分干扰，线性良好，日内及日间误差均符合要求。样品采用甲醇沉淀蛋白，方法简便，回收率高。本方法简易、快捷、准确，是适用于检测CTX血浆浓度的方法。
[参考文献]
[1]葛永前，陆国椿，凌云华.HPLC法测定人血浆中环磷酞胺的浓度[M].复旦学报(医学版),2002，29(3):213-215.
[2]Boddy AV,Ynle SM.Metabolism and harmacokinetic of oxazaphosphorines[J].Clin Pharmacokinet,2000,38(4):291.
[3]Kaijser GP,Beijnen JH,Jeunink EL,et al.Determination of chloroacetaldehyde,ametabolite of oxazaphosphorine cytostatic drugsin plasma[J].J Chromatogr,1993,614(2):253.
(收稿日期：2007-03-26), 百拇医药(何智义 吴艳萍 张婉婷 吴 芹)