原发胃癌中p15、p16基因蛋白表达检测
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[摘要]目的：检测胃癌患者手术切除后原发灶、转移灶及癌旁非癌组织中p15、p16基因蛋白表达情况，探讨p15、p16基因失活与胃癌的关系。方法：采用免疫组化方法以及计分制方法进行结果判定。结果：p15、p16基因在癌旁非癌组织、原发灶、转移灶中的蛋白表达的阳性率具有显著性差异，p15的蛋白表达比p16高，而且在癌旁非癌组织、原发灶和转移灶中阳性率逐渐降低。结论：p15、p16蛋白表达与胃癌癌变过程相关，可能是胃癌癌变过程的监测指标之一，某种程度上可以评价预后，p15、p16蛋白表达检测可以某种程度上作为胃癌的筛查指标之一。
[关键词]胃癌；肿瘤抑制基因
[中图分类号]R735.2 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2007)06(c)-139-02
胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，近年来的研究表明，胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程，但这一过程的分子生物学水平的发病机制尚不完全清楚[1]。p15、p16基因为细胞周期的负性调节因子，阻止细胞进入S期，故在肿瘤的发生中起重要作用[2]。本实验采用免疫组织化学方法，检测50例胃癌患者手术切除后原发灶、转移灶及癌旁非癌组织中胃癌p15、p16基因蛋白表达情况，旨在探讨p15、p16基因失活与胃癌转移扩散等病理生物学行为的关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 标本研究对象为1998年9月~1999年3月辽宁省肿瘤医院胃外科胃癌患者，选取手术切除后原发灶与转移灶、癌旁非癌组织配对的石蜡标本50例，其中男性32例，女性18例，男女比例为1.78∶1；最大年龄为79岁，最小年龄为39岁, 平均年龄(57.11±8.61)岁。50例癌旁非癌组织均为非癌黏膜上皮。以上病例均经病理诊断证实，所有患者术前均未经术前放疗、化疗等。
1.1.2 主要试剂及物品第一抗体及SP超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
1.2 实验方法
严格按照试剂盒说明书进行操作。
采用计分制方法进行结果判定：①胞浆染色，无染色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分；②高倍视野下计数细胞染色百分率，小于25%计0分、25%~50%计1分、50%~75%计2分、大于75%计3分。二者相加大于4分视为结果阳性。
1.3 统计学处理
实验结果采用SPSS10.0统计软件处理，检验显著性水准取α=0.05，P<0.05为有显著性并异。
2 结果
采用S-P法对50例胃癌组织进行了p15、p16免疫组织化学检测，结果p15、p16基因在癌旁非癌组织、原发灶、转移灶中的蛋白表达的阳性率分别为72%(36/50)和64%(32/50)、30%(15/50)和26%(13/50)、22.6%(12/53)和17%(9/53), p15的蛋白表达比p16高，而且在癌旁非癌组织、原发灶和转移灶中阳性率逐渐降低，具有显著性差异(P<0.05 )(图1~图4、表1)。
3 讨论
恶性肿瘤发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生异常改变，因此，检测p15、p16基因表达改变对胃癌的诊断具有一定意义[1,3]。至今，对成对的胃癌原发灶、转移灶和癌旁非癌组织的研究很少。p16基因在原发性肿瘤中虽然检不出突变，但存在不表达，检测p16有无缺失表达对胃癌早期诊断具有一定意义。有人报道p16在胃癌中有异常甲基化，而p15在这些恶性瘤中还没有定论[4]。
基因的甲基化导致其相应蛋白的表达缺失被认为是散在发生的恶性肿瘤MSI出现的主要机制[5]。本实验对50例胃癌癌旁非癌组织、原发灶、转移灶进行了p15、p16免疫组织化学检测，结果p15、p16基因在癌旁非癌组织、原发灶、转移灶中的蛋白表达的阳性率分别为72%(36/50)和64(32/50)、30%(15/50)和26%(13/50)、22.6%(12/53)和17%(9/53), p15的蛋白表达比p16的要高；而且在癌旁非癌组织、原发灶、和转移灶中阳性率逐渐降低，具有显著性差异。
相关研究表明p15基因启动子区高甲基化可使p15基因失活,但在不同肿瘤中p15基因甲基化的作用有差异[6]，原发胃癌的p15基因及其甲基化的异常集中在低分化胃癌，p15基因缺失和突变不是影响胃癌的主要因素，启动子区的高甲基化可能在晚期胃癌中起一定作用[7]。在胃癌中，p16基因失活与5'端启动子区域CpG岛异常甲基化密切相关。近年来，国内外许多学者研究表明，不管是原发性胃癌组织还是胃癌细胞系，不管采取何种方法均发现了较高的p16基因异常甲基化率，而非肿瘤组织中则没有或是出现极低的甲基化率[8]，这表明，p16基因失活是胃癌中的常见事件，并且与胃癌的发生、发展密切相关[9，10]。
综上所述,我们研究了原发胃癌的p15、p16基因蛋白表达的异常,发现60%以上的异常率，因此p15、p16基因失活与胃癌的相关性，抑癌基因的失活可能在晚期胃癌中起一定作用。
[参考文献]
[1]Herman JG,Graff JR,Myohanen S,et al. Methylation specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(18) :9821-9826.
[2]Chim CS, Liang R,Tam CY, et al. Methylation of p15 and p16 genes inacute promyelocytic leukemia:potential diagnostic and prognostic significance[J].J Clin Oncol，2001，19(7):2033-240.
[3]Puduvalli VK, Kyritsis AP, Hess KR, et al. Patterns of expression of Rb and p16 in astrocytic gliomas, and correlation with survival[J]. Int J Oncol, 2000, 17(5):963-969.
[4]Sakuma K, Chong JM, Sudo M,et al.High-density methylation of p14ARF and p16INK4A in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma[J] ......
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