ELISPOT技术的应用(1)
[关键词]酶联免疫斑点检测技术；应用
[中图分类号]R932-33[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2007)10(c)-007-02
酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)是一项非常先进的免疫学检测技术。结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(ELISA)的长处，能够分析经特异抗原活化后分泌细胞因子(如IFN-γ、TNF-α等)的单个效应细胞的频数，具有敏感、特异、易于重复的优点。这些独特优点让ELISPOT成为国际公认的检测抗原反应性效应细胞的最可靠的实验方法之一[1]，它目前已经成为抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。
1 ELISPOT技术的发展历史
ELISPOT形成今天的形势，历史上有几个关键的里程碑：①1983年，ELISPOT作为一种新的技术得到报道[2,3]；②检测IFN-γ分泌细胞的ELISPOT技术在1988年得到报道；③第一次在96孔板用硝酸纤维素膜和随后的PVDF板；④1997年，第一台全自动化的ELISPOT读板机面世[4]；⑤ELISPOT技术的应用得到报道，这种技术被认为是细胞免疫发展的一项关键性技术。目前，ELISPOT的技术得到了不断的发展，应用前景广阔。
, 百拇医药
2 ELISPOT的基本原理
此技术操作在96孔培养板上进行，直接以培养板的PVDF膜等为基质，包被上特异性单克隆抗体，之后，在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下，T细胞就开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方膜上的单克隆抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，可以在膜的局部形成一个个圆形斑点[5]。
3 ELISPOT 技术的优点
ELISPOT之所以得到广泛的应用，主要是由于它在检测抗原特异性细胞低频数时的高敏感性，比以流式细胞术为基础的技术(四聚体和细胞内细胞因子染色)的敏感性要高出1~2个数量级。另外ELISPOT是少数的几个可以利用冻存的PBMCs(外周血单个核细胞)来进行免疫监测分析的技术，而不丧失细胞的重要活性[6]，并且随着计算机辅助图像分析系统的使用，使大规模研究成为可能，这些对临床做回顾性或前瞻性研究都是很关键的因素。
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4 ELISPOT技术标准化与验证
由于ELISPOT检测的超高灵敏度，它的斑点形成容易受到诸多因素的影响。如果不采取措施，检测的重复性很难保证，这就要求对ELISPOT进行标准化和验证[7]。
4.1 ELISPOT技术的标准化
4.1.1 ELISPOT板首选96孔培养板。包被硝酸纤维素膜的培养板包被能力不一，常常导致培养孔周围形成小而弱的斑点。后来出现了PVDF膜，Weiss AJ[8]研究发现，这两种膜都有很高的蛋白结合能力，特别是PVDF板，可以获得更多，轮廓更清晰的斑点。随着ELISPOT IP和HP以及HTS板材的应用，质量得到了进一步的提升，包括优化的膜表面能阻止细胞向孔周边聚集以及防漏功能。曾有人应用塑料ELISA板，显示出更好的经济效益，但是因为其蛋白结合能力有限而不建议使用。一项研究中尽可能使用同一种板材，最好是同一批次。在已经验证了的操作规程中把硝酸纤维素板改成PVDF板就可能导致不理想的结果。同时还要检查生产厂家的质量控制程序，批次性能和是否达到生物分子筛查协会SBS制定的标准。
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4.1.2 包被规程使用PVDF，建议预湿时每孔加入15 μl的70%酒精来克服膜的疏水性。避免过长的孵育时间，因酒精的挥发会导致膜的高疏水性。酒精必须有效地被洗掉，残留的酒精会干扰斑点的形成。抗体的选择根据实验要求而定，还需考虑抗体敏感性等。商品试剂盒在检测同一个细胞因子的敏感性时可以相差10倍，所以需要进行标准化和验证。标准化中的一个重要参数是包被抗体总量，一般认为每孔约0.5~1.0 μg包被抗体可以得到理想的斑点。
4.1.3 细胞准备①细胞分离：由于红细胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影响T细胞功能，所以PBMCs的分离是必需的。如果经过处理和分离后红细胞在细胞沉淀中仍可看到，可以用低渗溶液溶解这些杂质红细胞。②冻存、贮藏和运输：冻存在细胞处理过程中最关键。冻存包括在约1° C/min的速度下冷冻细胞，同时加入细胞保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)。细胞的冻存有几种方法，自动控制降温机可以提供逐步智能降温，这在细胞最佳冻存及其标准化程序中是必需的。比较经济实用的方法就是使用装有异丙醇的冻存盒。血液样本处理，分离及冻存的最佳时间范围应该在8 h内或者在采集当天完成。PBMCs在抗凝剂中时间过长或在不合适的温度下过久，会影响PBMCs的功能，甚至可造成IFN-γ斑点形成细胞减少5倍以上。运输PBMCs的最好方式是专门制造的冷冻液氮装置，液氮被特别设计的泡沫衬里吸收，液氮慢慢挥发使气态氮充满运输容器里，样本可以在接近-140°C的恒定温度下保持10~18 d。气态氮是长期保存细胞的最佳方法，其关键是保持了一个恒定的温度，不断变化的温度会对细胞和细胞功能造成致命影响。不推荐用装干冰的运输盒来运送标本。③细胞复苏：细胞复苏过程中应用DNA酶能提高细胞的产出和降低细胞团块的形成，从而能够区别开离散的斑点形成细胞[9]。ELISPOT分析前最好让PBMCs休息过夜，可以使脆弱的、有凋亡倾向的细胞死亡，这样在分析前就可以估计出活力细胞的确切计数。
, 百拇医药
4.1.4 刺激抗原重组蛋白可以用来检测CD4+T细胞介导的反应，而对CD8+T细胞介导的反应有限[10]。对重组蛋白的反应依赖于APCs细胞的存在，APCs细胞在冻存后数量会减少，同时重组蛋白在不同贮藏温度下会出现溶解性和稳定性的问题。活的重组病毒载体或病毒感染细胞株也有相似的优缺点。重叠多肽池能用来鉴定CD4+和CD8+T细胞识别的最佳表位[11]。肽段越短，重叠越多，在鉴别MHC-Ⅰ表位时越精确，而不需要考虑可能的MHC-Ⅱ类反应，因为MHC-Ⅱ表位的氨基酸序列长度相对要长些，所以检测MHC-Ⅰ表位、MHC-Ⅱ表位时，在考虑合成肽价格的同时需要找到一个理想的平衡点。另外使用多肽时需注意多肽的纯度，污染序列就可以非特异地刺激细胞因子的产生。
4.1.5 细胞计数ELISPOT在细胞数量上需要很高的准确性，同时最少化死细胞的数量也很重要，因为死细胞的存在影响分析的正确性。常用台盼蓝排斥试验和对丝裂原反应来判断复苏后PBMCs的质量。Smith JG等人[12]试验表明检测细胞凋亡在判断细胞活力方面更有效，当凋亡小于18%时可以得到理想的结果。最近几年，一些自动化的设备在市场上出现，可以用来进行细胞计数和活力检测。
4.1.6 洗涤及斑点的形成洗涤程序可以手工也可以使用自动洗板机，但大批量清洗时手工会花去很长时间，从而造成孵育时间不一致。另外，手工清洗时如果缓冲液过少或压力过低都不能完全移除细胞和试剂，从而造成斑点增多以及孔的周边颜料聚集。因此，建议使用自动洗板机，一般要求至少使用两种不同的清洗缓冲液，同时可以调整清洗探针的高度和缓冲液的流量。斑点的形成规程跟ELISA规程相似，正确的抗体及其浓度必须通过验证后加以选择。最佳的抗体量常常需要参考生产厂商的要求。对于亲和素酶复合物也必须给予重视，酶的稳定性很重要，批间的酶变异性要很小，以保证实验的可比性。底物的选择能够影响斑点的检测数量。针对同一种酶的不同底物以及不同厂商生产的同一底物可能在敏感性上不同，从而造成斑点计数产生相当大的区别。, 百拇医药(聂 明 莫武宁)
[中图分类号]R932-33[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2007)10(c)-007-02
酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)是一项非常先进的免疫学检测技术。结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(ELISA)的长处，能够分析经特异抗原活化后分泌细胞因子(如IFN-γ、TNF-α等)的单个效应细胞的频数，具有敏感、特异、易于重复的优点。这些独特优点让ELISPOT成为国际公认的检测抗原反应性效应细胞的最可靠的实验方法之一[1]，它目前已经成为抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。
1 ELISPOT技术的发展历史
ELISPOT形成今天的形势，历史上有几个关键的里程碑：①1983年，ELISPOT作为一种新的技术得到报道[2,3]；②检测IFN-γ分泌细胞的ELISPOT技术在1988年得到报道；③第一次在96孔板用硝酸纤维素膜和随后的PVDF板；④1997年，第一台全自动化的ELISPOT读板机面世[4]；⑤ELISPOT技术的应用得到报道，这种技术被认为是细胞免疫发展的一项关键性技术。目前，ELISPOT的技术得到了不断的发展，应用前景广阔。
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2 ELISPOT的基本原理
此技术操作在96孔培养板上进行，直接以培养板的PVDF膜等为基质，包被上特异性单克隆抗体，之后，在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下，T细胞就开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方膜上的单克隆抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，可以在膜的局部形成一个个圆形斑点[5]。
3 ELISPOT 技术的优点
ELISPOT之所以得到广泛的应用，主要是由于它在检测抗原特异性细胞低频数时的高敏感性，比以流式细胞术为基础的技术(四聚体和细胞内细胞因子染色)的敏感性要高出1~2个数量级。另外ELISPOT是少数的几个可以利用冻存的PBMCs(外周血单个核细胞)来进行免疫监测分析的技术，而不丧失细胞的重要活性[6]，并且随着计算机辅助图像分析系统的使用，使大规模研究成为可能，这些对临床做回顾性或前瞻性研究都是很关键的因素。
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4 ELISPOT技术标准化与验证
由于ELISPOT检测的超高灵敏度，它的斑点形成容易受到诸多因素的影响。如果不采取措施，检测的重复性很难保证，这就要求对ELISPOT进行标准化和验证[7]。
4.1 ELISPOT技术的标准化
4.1.1 ELISPOT板首选96孔培养板。包被硝酸纤维素膜的培养板包被能力不一，常常导致培养孔周围形成小而弱的斑点。后来出现了PVDF膜，Weiss AJ[8]研究发现，这两种膜都有很高的蛋白结合能力，特别是PVDF板，可以获得更多，轮廓更清晰的斑点。随着ELISPOT IP和HP以及HTS板材的应用，质量得到了进一步的提升，包括优化的膜表面能阻止细胞向孔周边聚集以及防漏功能。曾有人应用塑料ELISA板，显示出更好的经济效益，但是因为其蛋白结合能力有限而不建议使用。一项研究中尽可能使用同一种板材，最好是同一批次。在已经验证了的操作规程中把硝酸纤维素板改成PVDF板就可能导致不理想的结果。同时还要检查生产厂家的质量控制程序，批次性能和是否达到生物分子筛查协会SBS制定的标准。
, http://www.100md.com
4.1.2 包被规程使用PVDF，建议预湿时每孔加入15 μl的70%酒精来克服膜的疏水性。避免过长的孵育时间，因酒精的挥发会导致膜的高疏水性。酒精必须有效地被洗掉，残留的酒精会干扰斑点的形成。抗体的选择根据实验要求而定，还需考虑抗体敏感性等。商品试剂盒在检测同一个细胞因子的敏感性时可以相差10倍，所以需要进行标准化和验证。标准化中的一个重要参数是包被抗体总量，一般认为每孔约0.5~1.0 μg包被抗体可以得到理想的斑点。
4.1.3 细胞准备①细胞分离：由于红细胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影响T细胞功能，所以PBMCs的分离是必需的。如果经过处理和分离后红细胞在细胞沉淀中仍可看到，可以用低渗溶液溶解这些杂质红细胞。②冻存、贮藏和运输：冻存在细胞处理过程中最关键。冻存包括在约1° C/min的速度下冷冻细胞，同时加入细胞保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)。细胞的冻存有几种方法，自动控制降温机可以提供逐步智能降温，这在细胞最佳冻存及其标准化程序中是必需的。比较经济实用的方法就是使用装有异丙醇的冻存盒。血液样本处理，分离及冻存的最佳时间范围应该在8 h内或者在采集当天完成。PBMCs在抗凝剂中时间过长或在不合适的温度下过久，会影响PBMCs的功能，甚至可造成IFN-γ斑点形成细胞减少5倍以上。运输PBMCs的最好方式是专门制造的冷冻液氮装置，液氮被特别设计的泡沫衬里吸收，液氮慢慢挥发使气态氮充满运输容器里，样本可以在接近-140°C的恒定温度下保持10~18 d。气态氮是长期保存细胞的最佳方法，其关键是保持了一个恒定的温度，不断变化的温度会对细胞和细胞功能造成致命影响。不推荐用装干冰的运输盒来运送标本。③细胞复苏：细胞复苏过程中应用DNA酶能提高细胞的产出和降低细胞团块的形成，从而能够区别开离散的斑点形成细胞[9]。ELISPOT分析前最好让PBMCs休息过夜，可以使脆弱的、有凋亡倾向的细胞死亡，这样在分析前就可以估计出活力细胞的确切计数。
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4.1.4 刺激抗原重组蛋白可以用来检测CD4+T细胞介导的反应，而对CD8+T细胞介导的反应有限[10]。对重组蛋白的反应依赖于APCs细胞的存在，APCs细胞在冻存后数量会减少，同时重组蛋白在不同贮藏温度下会出现溶解性和稳定性的问题。活的重组病毒载体或病毒感染细胞株也有相似的优缺点。重叠多肽池能用来鉴定CD4+和CD8+T细胞识别的最佳表位[11]。肽段越短，重叠越多，在鉴别MHC-Ⅰ表位时越精确，而不需要考虑可能的MHC-Ⅱ类反应，因为MHC-Ⅱ表位的氨基酸序列长度相对要长些，所以检测MHC-Ⅰ表位、MHC-Ⅱ表位时，在考虑合成肽价格的同时需要找到一个理想的平衡点。另外使用多肽时需注意多肽的纯度，污染序列就可以非特异地刺激细胞因子的产生。
4.1.5 细胞计数ELISPOT在细胞数量上需要很高的准确性，同时最少化死细胞的数量也很重要，因为死细胞的存在影响分析的正确性。常用台盼蓝排斥试验和对丝裂原反应来判断复苏后PBMCs的质量。Smith JG等人[12]试验表明检测细胞凋亡在判断细胞活力方面更有效，当凋亡小于18%时可以得到理想的结果。最近几年，一些自动化的设备在市场上出现，可以用来进行细胞计数和活力检测。
4.1.6 洗涤及斑点的形成洗涤程序可以手工也可以使用自动洗板机，但大批量清洗时手工会花去很长时间，从而造成孵育时间不一致。另外，手工清洗时如果缓冲液过少或压力过低都不能完全移除细胞和试剂，从而造成斑点增多以及孔的周边颜料聚集。因此，建议使用自动洗板机，一般要求至少使用两种不同的清洗缓冲液，同时可以调整清洗探针的高度和缓冲液的流量。斑点的形成规程跟ELISA规程相似，正确的抗体及其浓度必须通过验证后加以选择。最佳的抗体量常常需要参考生产厂商的要求。对于亲和素酶复合物也必须给予重视，酶的稳定性很重要，批间的酶变异性要很小，以保证实验的可比性。底物的选择能够影响斑点的检测数量。针对同一种酶的不同底物以及不同厂商生产的同一底物可能在敏感性上不同，从而造成斑点计数产生相当大的区别。, 百拇医药(聂 明 莫武宁)