氨基胍对帕金森病小鼠黑质内多巴胺能神经元的保护作用(1)
[摘要] 目的：观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)特异性抑制剂氨基胍(AG)对帕金森病模型小鼠黑质内多巴胺(DA)能神经元的影响。方法：采用Lau法制作PD小鼠模型，通过行为学观察和免疫印迹法，观察PD小鼠模型的行为学表现，及腹侧中脑(包括VTA和SN)iNOS、酪氨酸羟化酶(TH)表达水平的变化。并观察给予iNOS抑制剂AG后对上述变化的影响。结果：与对照小鼠相比，PD小鼠出现PD典型的行为学表现，腹侧中脑TH含量下降约77%,同时iNOS含量大幅度升高。经iNOS抑制剂AG处理的PD小鼠行为表现明显减轻，腹侧中脑TH含量仅下降约41%，腹侧中脑iNOS含量也较模型组明显为低。结论：iNOS的表达与PD模型小鼠黑质内DA能神经元的丢失有关；AG可能对PD模型小鼠黑质内DA能神经元有保护作用。
[关键词] 氨基胍；诱导型一氧化氮合酶；多巴胺；帕金森病；酪氨酸羟化酶
[中图分类号] R742.5[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2007)12(c)-017-02
, http://www.100md.com
帕金森病(Parkinson＇s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元进行性变性丢失为主要神经病理学特征，但PD的病因和发病机制仍不清楚。尸检标本发现，PD患者黑质致密部诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide, iNOS)高度活化，其神经毒性产物——一氧化氮(nitric oxide，NO)大量表达[1]，提示iNOS在PD发病过程中可能起重要作用。由于iNOS表达能够为氨基胍(aminogunidine, AG)特异性抑制[2]，故AG可能对PD患者黑质中的DA能神经元起保护作用。我们采用Lau法[3]制作PD小鼠模型，观察模型动物中脑iNOS表达，DA能神经元数量的改变，及给予iNOS特异性抑制剂AG后对上述改变的影响，探讨iNOS和AG在PD发病中的可能作用，为今后探讨PD的防治策略提供线索。
1 材料与方法
1.1实验试剂
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MPTP(Sigma，USA)，Probenecid(Sigma，USA)，Aminogunidine (Sigma，USA)，兔抗iNOS单克隆抗体(Neomarkers，CAN)，兔抗TH单克隆抗体(Sigma，USA)，生物素标记的羊抗兔IgG抗血清(迈新生物生物技术公司)。
1.2动物分组和模型制备
健康雄性C57BL/6N 小鼠30只，6～8周龄，体质量18～23 g，由华北煤炭医学院实验动物中心提供，自由进食饮水，室温(25±2)℃，单笼喂养，自然光照。将大鼠随机分为3组，每组10只。模型组(PD组)：给予MPTP(25 mg/kg，生理盐水溶解，皮下注射)和Probenecid(250 mg/kg，二甲亚砜溶解，腹腔注射)10次，2次/周，共5周；iNOS抑制剂组(AG组)：除给予PD组相同的MPTP和Probenecid处理外，从实验第一天起每天给予AG 1 次 (50 mg/kg，盐水溶解，腹腔注射)直至处死；对照组(control组)：注射与PD组等体积盐水+ DMSO。上述动物分别于实验开始后8周处死。
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1.3免疫印迹(Western-blot)
按《分子克隆实验指南》[4]操作，取8周鼠脑检测iNOS蛋白和DA能神经元标志性蛋白——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)。将小鼠麻醉后，取脑，切取腹侧中脑部分，置于细胞裂解液中，低温匀浆，静置10 min 后加入90 μl 100 g/L NP-40，剧烈震荡30 s ，4℃ 13 000 g 离心15 min ，取上清，分装，-80 ℃保存备用。蛋白定量后加入4倍样本缓冲液，95℃变性5 min 。取30 μg 样品在100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，电转至硝酸纤维素(NC)膜，切取相应条带分别加兔抗COX-2单克隆抗体(1∶400)和兔抗TH单克隆抗体(1∶1 500)，4℃过夜，TBST冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔IgG抗血清(1∶100)室温下振荡孵育1.5 h，TBST洗涤后，与卵白素-辣根过氧化物酶复合物室温下孵育2 h，DAB显色。将NC膜用扫描仪进行扫描，在同一条件下应用CMIAS真彩医学图像分析系统(北京航空航天大学研制)测定条带平均灰度值。
1.4 统计分析
实验数据均用均数±标准差(x±s)表示，并输入计算机使用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。分别采用单因素方差分析、q检验。P, http://www.100md.com(师 亮 王 彤 景 雅 张宇新)
[关键词] 氨基胍；诱导型一氧化氮合酶；多巴胺；帕金森病；酪氨酸羟化酶
[中图分类号] R742.5[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2007)12(c)-017-02
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帕金森病(Parkinson＇s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元进行性变性丢失为主要神经病理学特征，但PD的病因和发病机制仍不清楚。尸检标本发现，PD患者黑质致密部诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide, iNOS)高度活化，其神经毒性产物——一氧化氮(nitric oxide，NO)大量表达[1]，提示iNOS在PD发病过程中可能起重要作用。由于iNOS表达能够为氨基胍(aminogunidine, AG)特异性抑制[2]，故AG可能对PD患者黑质中的DA能神经元起保护作用。我们采用Lau法[3]制作PD小鼠模型，观察模型动物中脑iNOS表达，DA能神经元数量的改变，及给予iNOS特异性抑制剂AG后对上述改变的影响，探讨iNOS和AG在PD发病中的可能作用，为今后探讨PD的防治策略提供线索。
1 材料与方法
1.1实验试剂
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MPTP(Sigma，USA)，Probenecid(Sigma，USA)，Aminogunidine (Sigma，USA)，兔抗iNOS单克隆抗体(Neomarkers，CAN)，兔抗TH单克隆抗体(Sigma，USA)，生物素标记的羊抗兔IgG抗血清(迈新生物生物技术公司)。
1.2动物分组和模型制备
健康雄性C57BL/6N 小鼠30只，6～8周龄，体质量18～23 g，由华北煤炭医学院实验动物中心提供，自由进食饮水，室温(25±2)℃，单笼喂养，自然光照。将大鼠随机分为3组，每组10只。模型组(PD组)：给予MPTP(25 mg/kg，生理盐水溶解，皮下注射)和Probenecid(250 mg/kg，二甲亚砜溶解，腹腔注射)10次，2次/周，共5周；iNOS抑制剂组(AG组)：除给予PD组相同的MPTP和Probenecid处理外，从实验第一天起每天给予AG 1 次 (50 mg/kg，盐水溶解，腹腔注射)直至处死；对照组(control组)：注射与PD组等体积盐水+ DMSO。上述动物分别于实验开始后8周处死。
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1.3免疫印迹(Western-blot)
按《分子克隆实验指南》[4]操作，取8周鼠脑检测iNOS蛋白和DA能神经元标志性蛋白——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)。将小鼠麻醉后，取脑，切取腹侧中脑部分，置于细胞裂解液中，低温匀浆，静置10 min 后加入90 μl 100 g/L NP-40，剧烈震荡30 s ，4℃ 13 000 g 离心15 min ，取上清，分装，-80 ℃保存备用。蛋白定量后加入4倍样本缓冲液，95℃变性5 min 。取30 μg 样品在100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，电转至硝酸纤维素(NC)膜，切取相应条带分别加兔抗COX-2单克隆抗体(1∶400)和兔抗TH单克隆抗体(1∶1 500)，4℃过夜，TBST冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔IgG抗血清(1∶100)室温下振荡孵育1.5 h，TBST洗涤后，与卵白素-辣根过氧化物酶复合物室温下孵育2 h，DAB显色。将NC膜用扫描仪进行扫描，在同一条件下应用CMIAS真彩医学图像分析系统(北京航空航天大学研制)测定条带平均灰度值。
1.4 统计分析
实验数据均用均数±标准差(x±s)表示，并输入计算机使用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。分别采用单因素方差分析、q检验。P, http://www.100md.com(师 亮 王 彤 景 雅 张宇新)