凝胶法细菌内毒素检查中的有关注意事项
[关键词] 凝胶法；细菌内毒素
[中图分类号]R927.1 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210(2007)12(c)-249-01
药品细菌内毒素检查法是一项操作简便、快速、标准化程度高、应用成本低的新技术，又是一项生物学反应复杂的体外检测方法。其试验原理是内毒素与鲎试剂反应形成易于分辨的凝胶。因其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测多个样品等优点，目前被广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学以及微生物学中。
为了保证注射剂药品的使用安全，传统的方法是采用家兔热原检查法。1968年美国学者J.Levin和F.Bang创建了微量细菌内毒素的鲎试验法，许多学者致力于以鲎试验法替代家兔热原法的研究。我国药典2005版共收载了112个品种，笔者做过几十个品种的药品细菌内毒素检验，发现凝胶法细菌内毒素检查法影响因素较多，实验操作的准确性尤为重要，存在的问题仍需多方面努力进行克服。因此，笔者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，以下体会供同行们参考。
, http://www.100md.com
1 鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，药品的细菌内毒素检查又是关系到药品安全性的重要检查项。细菌内毒素检查法自药典收载以来，每版都有明确规定：每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验，其意义在于：①验证鲎试剂灵敏度是否准确；②考查实验室条件；③考察实验人员操作技能；④验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性，检验人员应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复核。
2 细菌内毒素标准品
细菌内毒素工作标准品效价误差或效价不稳定，可影响实验结果，建议选用中检所提供的细菌内毒素工作标准品，必要时或有条件者应标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素标准品溶解后一定要在旋涡混合器上混合15 min，以后每一步稀释要至少混合30 s。如不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高，阳性对照不凝等不正确的实验结果。
, 百拇医药
3 细菌内毒素检查用水(BET水)
BET水是一种特殊的灭菌注射用水，它不仅是要求细菌内毒素含量小于0.015 EU/ml(凝胶法)，而且要求有严格的pH值(6.0～8.0)范围，建议选用中检所或鲎试剂厂家配备的细菌内毒素检查用水，绝不能用注射用水替代使用。
4 干扰试验
干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。建议在做正式干扰试验前先做干扰试验预试验，目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰试验提供依据。这样做大大减少了实验的盲目性，即可以节省时间又可以节省大量的鲎试剂。
5 检查法中的各种对照
在进行常规细菌内毒素检查时，规定了阳性对照(PC),阴性对照(NC)及供试品阳性对照(PPC),阳性对照的目的是证明在实验条件下所用鲎试剂灵敏度是否符合规定，阴性对照的目的是证明所用的BET水中不存在可被检测到的内毒素，供试品阳性对照的目的是证明在试验条件下被检测的供试品保证不存在抑制因素。当进行常规细菌内毒素检查时，以上各种对照应同时进行，在认可试验有效的条件下才能进行结果判断。
, 百拇医药
6 其他注意事项
6.1 实验器具的洁净度
一般用硫酸清洁液浸泡4 h，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍，干热(250℃)恒温1.5 h即可。
6.2 实验操作的误差
操作顺序和熟练程度尤为重要，实验顺序如下所示：①制备内毒素标准溶液→②稀释样品→③溶解鲎试剂→④摆放试管→⑤加样或加试剂→⑥封口恒温→⑦观察结果并记录。
6.3 实验条件
实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。
6.4 温度
实验室温度为(25±2)℃较为理想，恒温水箱温度为(37±1)℃为宜。
6.5 样品本身干扰
对含有多糖类药品，应选用特异性鲎试剂或普通鲎试剂加G因子抑制剂使用。
(收稿日期：2007-10-10), 百拇医药(王欣放 王晓雷)
[中图分类号]R927.1 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210(2007)12(c)-249-01
药品细菌内毒素检查法是一项操作简便、快速、标准化程度高、应用成本低的新技术，又是一项生物学反应复杂的体外检测方法。其试验原理是内毒素与鲎试剂反应形成易于分辨的凝胶。因其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测多个样品等优点，目前被广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学以及微生物学中。
为了保证注射剂药品的使用安全，传统的方法是采用家兔热原检查法。1968年美国学者J.Levin和F.Bang创建了微量细菌内毒素的鲎试验法，许多学者致力于以鲎试验法替代家兔热原法的研究。我国药典2005版共收载了112个品种，笔者做过几十个品种的药品细菌内毒素检验，发现凝胶法细菌内毒素检查法影响因素较多，实验操作的准确性尤为重要，存在的问题仍需多方面努力进行克服。因此，笔者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，以下体会供同行们参考。
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1 鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，药品的细菌内毒素检查又是关系到药品安全性的重要检查项。细菌内毒素检查法自药典收载以来，每版都有明确规定：每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验，其意义在于：①验证鲎试剂灵敏度是否准确；②考查实验室条件；③考察实验人员操作技能；④验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性，检验人员应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复核。
2 细菌内毒素标准品
细菌内毒素工作标准品效价误差或效价不稳定，可影响实验结果，建议选用中检所提供的细菌内毒素工作标准品，必要时或有条件者应标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素标准品溶解后一定要在旋涡混合器上混合15 min，以后每一步稀释要至少混合30 s。如不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高，阳性对照不凝等不正确的实验结果。
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3 细菌内毒素检查用水(BET水)
BET水是一种特殊的灭菌注射用水，它不仅是要求细菌内毒素含量小于0.015 EU/ml(凝胶法)，而且要求有严格的pH值(6.0～8.0)范围，建议选用中检所或鲎试剂厂家配备的细菌内毒素检查用水，绝不能用注射用水替代使用。
4 干扰试验
干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。建议在做正式干扰试验前先做干扰试验预试验，目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰试验提供依据。这样做大大减少了实验的盲目性，即可以节省时间又可以节省大量的鲎试剂。
5 检查法中的各种对照
在进行常规细菌内毒素检查时，规定了阳性对照(PC),阴性对照(NC)及供试品阳性对照(PPC),阳性对照的目的是证明在实验条件下所用鲎试剂灵敏度是否符合规定，阴性对照的目的是证明所用的BET水中不存在可被检测到的内毒素，供试品阳性对照的目的是证明在试验条件下被检测的供试品保证不存在抑制因素。当进行常规细菌内毒素检查时，以上各种对照应同时进行，在认可试验有效的条件下才能进行结果判断。
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6 其他注意事项
6.1 实验器具的洁净度
一般用硫酸清洁液浸泡4 h，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍，干热(250℃)恒温1.5 h即可。
6.2 实验操作的误差
操作顺序和熟练程度尤为重要，实验顺序如下所示：①制备内毒素标准溶液→②稀释样品→③溶解鲎试剂→④摆放试管→⑤加样或加试剂→⑥封口恒温→⑦观察结果并记录。
6.3 实验条件
实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。
6.4 温度
实验室温度为(25±2)℃较为理想，恒温水箱温度为(37±1)℃为宜。
6.5 样品本身干扰
对含有多糖类药品，应选用特异性鲎试剂或普通鲎试剂加G因子抑制剂使用。
(收稿日期：2007-10-10), 百拇医药(王欣放 王晓雷)