抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定(2)
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1.2.2杂交瘤细胞株的建立细胞融合、筛选及克隆化。取加强免疫后小鼠，眼眶采血后处死，酒精消毒后平皿中取脾，转移至50 ml离心管中，加RPMI 1640至30 ml稀释后取1×108 个细胞备用。取SP2/0细胞1×107个与之前的脾细胞混合离心，1 500~2 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀弹成糊状，37℃水浴，1 min内加入1 ml PEG并搅拌，37℃水浴放置1 min。分别在1、2、3 min内加入1、4、15 ml RPMI 1640终止融合，800 r/min离心7 min。弃上清弹匀细胞，加入HAT培养液，混匀后，滴入96孔板，放入CO2培养箱中，并定时换液，同时用CLCN5/GST融合蛋白和GST蛋白做包被抗原，采用间接ELISA筛选细胞培养上清，阳性克隆以有限稀释法克隆化。
1.3 抗 CLCN5 mAb的特性鉴定
1.3.1抗CLCN5抗血清效价测定应用ELISA的方法对免疫后的融合鼠血清进行效价测定。
1.3.2 ELISA筛选采用酶联免疫吸附试验测定抗体效价。首先用纯化的抗原蛋白包被96孔酶联板，4℃过液或37℃ 2 h，洗液洗涤3次，加封闭液4℃过液或37℃2 h后洗3次，拍干，4℃保存。将融合细胞上清加样到包被好的酶标板上，每板取无细胞生长的2孔为阴性对照，再选无细胞生长的2孔加阳性血清，作为阳性对照，37℃孵育30 min洗板4次，拍干，加入1∶5 000稀释的酶标二抗37℃孵育30 min，洗板4次，拍干。37℃ DAB显色15~30 min，加终止液，450 nm测定OD值。
1.3.3Western blot鉴定mAb 的特异性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将样品与样品缓冲液按3∶1的比例混匀，100℃水浴加热3～5 min。按《分子克隆》制备分离胶和浓缩胶溶液，待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将样品孔中依次加入Marker、HSG胞浆蛋白、CLCN5蛋白和含GST标签蛋白各8、3、10 、10 μl。在恒压80 V条件下开始电泳，至样品溶液进入分离胶后将电压调至180 V，直至电泳结束。免疫印迹法检测抗体的反应性和特异性：取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于TF缓冲液30 min。另取与凝胶同样大小的厚滤纸2张，硝酸纤维素膜(PVDF膜)1张，用TF缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移。在电极板上依次放上湿厚滤纸1张，硝酸纤维素膜1张，电泳凝胶，湿滤纸3张 ......
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