丹参红景天合剂对大鼠肾间质纤维化CTGF表达的影响(1)
 |
| 第1页 |
参见附件(296KB，2页)。
[摘要] 目的：观察丹参红景天合剂对大鼠肾间质纤维化结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，验证其对大鼠肾间质纤维化的防治和对肾的保护作用，为临床用药提供依据。方法：采用大鼠单侧输尿管结扎(UUO)致肾间质纤维化模型。将雄性Wistar大鼠30只随机分为假手术组(打开腹腔后分离左侧输尿管，不结扎即关闭腹腔，正常饮水饮食)、模型组(打开腹腔后分离左侧输尿管并结扎，关闭腹腔，具体方法见文献，正常饮水饮食)和丹参红景天合剂组[造模同模型组，并于造模前1 d开始灌胃给予丹参红景天合剂，剂量为10 ml/(kg·d)]，每组10只，术后第9天处死大鼠，经免疫组织化学、Western蛋白印迹分析方法观察各组CTGF的表达部位及蛋白表达水平。用免疫组化半定量测定α-SMA的表达水平。用Masson染色评定各组肾小管间质损害程度。结果：模型组与假手术组的CTGF、α-SMA蛋白表达及肾小管间质损伤指数比较有显著性差异(P<0.01)，丹参红景天合剂组与模型组比较具有显著性差异(P<0.01)。把各组CTGF蛋白水平与相应的纤维化指标进行相关性分析，结果显示，CTGF与α-SMA(r=0.985，P<0.05)、肾小管间质损伤指数(r=0.867，P<0.05)均呈正相关。结论：丹参红景天合剂可以通过下调CTGF而减轻肾间质纤维化。
[关键词] 丹参红景天合剂；CTGF；肾间质纤维化；大鼠
[中图分类号] R961 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210(2008)02(a)-027-02
肾小管间质纤维化(TIF)是所有慢性肾脏疾病发展的最终结果，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。无论是各种原发性肾小球疾病，还是糖尿病、输尿管阻塞，肾功能的损害都与肾脏纤维化病变的程度密切相关。这些疾病能引起肾小管上皮细胞的凋亡、肾间质炎性细胞的浸润、肌成纤维细胞的聚集，并在一些促纤维化因子的参与下，使细胞外基质(ECM)生成增多、降解减少，而产生肾间质纤维化，导致肾功能严重受损[1]。有资料证明，结缔组织生长因子(CTGF)作为介导TCF-β1促纤维化的下游蛋白因子，对间质来源细胞如成纤维细胞具有特异地促细胞增生和细胞外基质合成生物学效应，已成为纤维化病变研究的热点[2]。
近年来，西医治疗肾间质纤维化未有突破性进展，且长期服用西药副作用大，故在TIF的防治方面以中药为主。文献资料中，丹参红景天对肾脏病变的防治作用虽有报道，但多为临床报道，缺乏相应的动物实验数据。本实验用中药丹参红景天合剂对肾小管间质纤维化防治作用进行了动物实验研究，通过CTGF、蛋白表达及肾小管间质损伤指数的研究测定并做统计分析，为丹参红景天合剂抗肾小管间质纤维化提供了科研依据，并为丹参红景天合剂在临床中的应用提供了参考资料。
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组
采用大鼠单侧(左侧)输尿管结扎法(UUO)[3]制造肾小管间质纤维化模型。将30只健康雄性Wistar大鼠(湖南中医药大学动物实验中心提供)，体重(130.00±5.12)g，常规下适应饲养1周后随机分为3组，假手术组(打开腹腔后分离左侧输尿管，不结扎即关闭腹腔，正常饮水饮食)、模型组(打开腹腔后分离左侧输尿管并结扎，关闭腹腔，正常饮水饮食)、丹参红景天合剂组[造模同模型组，于造模前1 d开始灌胃给予丹参红景天合剂，剂量为10 ml/(kg·d)]。丹参红景天合剂制备按文献[4]，每组各10只。于术后第9天处死各组大鼠。各组分别取梗阻侧肾组织标本，部分组织用10%中性福尔马林浸泡3 d后脱水、石蜡包埋、切片，部分作Western蛋白印迹分析。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 免疫组化染色方法CTGF、α-SMA采用ABC法。3 μm厚的石蜡切片常规脱蜡水化，用3%H2O2的甲醇封闭内源性过氧化酶(如测CTGF则加用1 mg/ml胰蛋白酶于37℃ 30 min修复抗原)，1%BSA(牛血清白蛋白)于室温30 min封闭非特异性抗原。加兔抗人CTGF多克隆抗体(1∶400)或小鼠抗人α-SMA单克隆抗体(1∶100)于4℃冰箱过夜。再加生物素标记羊抗兔Ⅱ抗(1∶200)室温30 min，辣根过氧化酶-卵白素(1∶400)室温30 min，DAB显色7 min后用自来水冲洗终止显色，苏木精轻度复染1 min，常规脱水、透明、封片。同时用正常血清作阴性对照(所有试剂均由武汉博士德公司提供)。
1.2.2 α-SMA半定量分析采用计算机BioMaix多媒体彩色病理图像分析软件。显微镜200倍下分别取15个不重复的肾小管间质视野，按阳性组织所占视野百分比进行半定量评分后取均值。
1.2.3 肾小管间质的病理评分Masson染色后在显微镜200倍下分别于左上、左下、右上、右下、中间各取2个视野，每张切片共取10个视野，依据小管扩张、小管细胞空泡变性、小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质细胞浸润、间质水肿、间质纤维化8项指标来观察肾间质病理改变并作肾间质损伤指数评分[5]。
1.2.4 CTGF的蛋白水平采用Western蛋白印迹检测。取梗阻左侧肾组织，加裂解液后匀浆、离心，取上清液测蛋白浓度。加蛋白上样液于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜上，5%无脂奶粉封闭，加兔抗人CTGFⅠ抗孵育4℃过夜。含0.1%吐温PBS洗膜，辣根过氧化酶标记的抗兔IgG中孵育1 h，洗膜，以化学发光法显示结果。取假手术组同侧肾组织作对照。
1.3 统计学方法
完全随机设计多样本均数的计量资料用方差分析。统计过程全部在SPSS13.0中进行。
2 结果
2.1 各组肾小管间质损伤指数、CTGF及α-SMA半定量比较
模型组较假手术组明显增高，两组比较其差异有统计学意义(P<0.01)，丹参红景天合剂组上述指标较模型组明显减少，其差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
2.2 相关分析
把各组CTGF蛋白水平与相应的纤维化指标进行相关分析，结果显示，CTGF与α-SMA(r=0.985，P<0.05)、CTGF与肾小管间质(r=0.867，P<0.05)损伤指数均呈正相关。
3 讨论
肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路，是导致慢性肾衰竭的病理基础，而多种生长因子在肾间质纤维化过程中发挥了极为重要的作用。研究表明，CTGF的过度表达是各种肾小管间质病发生、发展的重要因素之一[6]，它参与了肾间质纤维化的多个环节。本实验我们采用UUO致大鼠肾间质纤维化模型观察了肾间质急性损伤的发生、发展以及最终出现纤维化的过程，结果显示，CTGF在模型组表达明显增高，并与肾小管间质损伤指数、α-SMA呈正相关关系，提示CTGF在肾小管间质纤维化中有重要的致病作用。
国内外研究证明，间质浸润的炎性细胞通过产生大量的细胞因子如CTGF、TCF-β1等促进肾间质纤维化的形成[7]，同时肾间质增殖、活化的成纤维细胞及小管上皮细胞亦是CTGF的主要来源。研究表明，持续性输尿管梗阻首先出现肾小管上皮细胞及血管内皮细胞损伤，继而单核-巨噬细胞为主的炎症细胞浸润，最终发展为间质纤维化。因此，阻断CTGF与浸润的炎症细胞、活化的成纤维细胞及肾小管上皮细胞之间的作用，将抑制肾间质纤维化的发生、发展。
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(296KB，2页)。