紫杉醇诱导人胃癌MGC803细胞凋亡作用研究(1)
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[摘要] 目的：研究胃癌发生过程中原位细胞凋亡活动以及紫杉醇对人胃癌细胞系MGC803诱导细胞凋亡的作用。方法：用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测了胃癌MGC803细胞凋亡, 用紫杉醇处理培养胃癌细胞MGC803、显微镜下进行观察并且进行琼脂糖电泳，流式细胞仪检测细胞周期分布和端粒体酶活性检测。结果：癌旁对照组原位凋亡细胞增多, 紫杉醇处理胃癌细胞可以诱导细胞产生典型的细胞凋亡变化。DNA发生断裂, 琼脂糖电泳产生梯形条带，细胞阻滞于G2/M期，端粒体酶活性下降。结论：在体内肿瘤细胞凋亡降低, 细胞分裂可加快，癌旁对照中细胞凋亡增多, 体外紫杉醇可以诱导胃癌细胞系MGC803凋亡。
[关键词] 胃癌；细胞凋亡；紫杉醇
[中图分类号] R735.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2008)04(b)-011-03
Study of apoptosis in human gastric cancer MGC803 cell and the induction by Paclitaxel
ZOU Yu1,FEI Hong-xin1*,HUANG Xiao-yi2,SUN Li-hui1,LI Lin1
(1.QiqiharMedical University,Qiqihar 161042，China；2.Department ofGenetics ,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective:To investigate the action of insitu apoptosis in occurrence of gastric cancer and the biological effect of Paclitaxel on MGC803 cell line inducing apoptosis. Methods:The apoptosis in the gastric cancer detected with terminal deoxynucl neotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) , the MGC803 cell line cultured in medium were treated with Paclitaxel and observed undermicroscope, and their DNA was assayed by gel electrophoresis, Flow cytometry analysis was used to observe the cell cycle, the effect measured telomerase.Results: In situ apoptosis cells in the cancer adjacent tissues inceased； treatment of gastric cancer with Paclitaxel could induce the cells to manifest a typical apoptosis morphology. Their DNA was fractured and a characteristic ladder pattern could be found using electrophoresis, which was associated with arrest of G2/M phase, and inhibited telomerase activity.Conclusion:In vivo the apoptosis of gastric cancer lower, maybe the cells divide quickly and then the cancers occur. In the cancer adjacent tissues, the apoptosis prick up, and in vitro Paclitaxel can induce the apoptosis of MGC803 cells.
[Key words] Gastric cancer；Apoptosis；Paclitaxel
肿瘤的发生机制之一是由于正常的细胞凋亡过程被抑制，破坏了细胞增殖与凋亡之间平衡的结果[1]。为了探讨胃癌发生中细胞凋亡的作用，我们利用脱氧核糖核酸末端转移酶介导(TUNEL)的缺口末端标记法，测定了胃细胞癌的细胞凋亡情况。紫杉醇是应用非常广泛的抗癌新药，采用培养胃癌细胞MGC803体外实验方法，研究了紫杉醇对胃癌细胞凋亡的诱导作用。
1 材料与方法
1.1材料、试剂和仪器
人胃癌MGC803细胞由哈尔滨医科大学黄小义博士提供，PA系Sigma 公司，RPMI-1640培养液 Gibco /BRL公司(USA)，胎牛血清系Sigma 公司，碘化丙啶系 Sigma公司， RNase A系Sigma公司，全自动酶标仪 Multis Ascent 公司，超纯水仪系Purelabplus公司，流式细胞仪系FACS Calibur公司(USA)，原位细胞凋亡检测试剂盒系武汉博士德生物工程公司。
1.2细胞培养
常规复苏人胃癌MGC803细胞，细胞培养在经过0.22 μm滤膜过滤RPMI-1640培养液中(含10%热灭活胎牛血清，0.2%NaHCO3，青霉素100 U/ml)，在37℃、5%的CO2培养箱进行培养，用PBS配制的0.15% 的胰蛋白酶(含有0.02%的EDTA)消化细胞传代， 每周传代1～2 次，收集指数生长期MGC803细胞用于实验研究。
1.3原位细胞凋亡检测
TUNEL法检测凋亡细胞按说明书进行，阴性对照:以标记缓冲液代替TdT和DIG -dUTP，阳性对照为肿瘤细胞，细胞核中有棕黄色者为阳性细胞，计算阳性率(各组中出现阳性例数与各组例数的比率为阳性率)，每一标本随机选取4个视野， 200倍下测量其积分光密度( DD )值，数据以积分光密度( DD )的平均值±标准差表示，对胃癌组织，癌旁对照中阳性进行测定。
1.4琼脂糖凝胶电泳
观察光学显微镜下细胞形态并照相，并观察凋亡细胞情况。DNA分离和电泳:将待测细胞用PBS洗2遍，离心沉淀获得肿瘤细胞5×105个/ml，加入50 μl细胞裂解液，混匀，37℃水浴保温至混合物变清，12 000转/min于4 ℃离心5 min，将上清液转到微量离心管中，以等体积的苯酚/氯仿、苯酚/氯仿/异丙醇(25∶24:1)和氯仿各抽提1次，然后在上清液中加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠和2倍体积的冷乙醇溶液，-20℃过夜， 12 000 转/min离心10 min，将沉淀溶于20 μl TE溶液中，加入1 μl RNA酶，37℃保温1 h，加入4 μl样品缓冲液，电泳1～2 h后记录结果。
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