微生物检查方法验证及其影响因素分析(2)
参见附件(584kb)。
2.3.4 控制菌方法验证的结果判断按照2005年版《中国药典》的规定，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
2.4 特殊供试品的制备
由于有些供试品本身的特性，可能含有抑菌成分，对药品中污染的微生物造成损伤或药品本身色泽会掩盖微生物的肉眼检出，造成假阴性。而这些被微生物污染的药品进入人体后，有些微生物会复苏并繁殖，危及人体健康。在实践中，利用供试品与微生物的差异，来降低或消除供试品对药品中微生物的影响，做到准确检定出药品中微生物的含量，是经常采用的方法。具体包括：
(1)培养基稀释法——计数试验采用此法，1 ml分注入几个平皿(≤10个平皿)降低抑菌浓度或减少供试品的色泽。
(2)薄膜过滤法——利用微孔滤膜阻截细菌，以滤除可溶性成分。
(3)中和法——中和剂应对微生物无毒性，与抑菌性成分结合后的产物对微生物亦应无毒性，或有毒性但不能影响待检菌的检出。如β-内酰胺酶较易破坏青霉素和第一代头孢菌素。
(4)离心沉淀法——悬浮于供试液中的药物颗粒及细菌，由于质量不同可用不同的离心速度分离，一般以短时间低速离心沉淀即可使多数药物颗粒集于管底，难溶性抑菌成分便可借以分离，吸取上层大部分供试液，即可减除其中的抑菌成分。但可能有一些吸附在固体颗粒的微生物随着颗粒被处理掉。细菌细胞个体虽小，但其比重略高于水溶液，可用高速离心将菌细胞收集于管底，弃去上层大部分清液，取管底沉淀液做待检菌检查，可避免抑菌成分对检查的干扰。低速离心一般采用500转/min 离心5 min，收集上清液(菌在上清液中)；高速离心一般采用3 000转/min 离心30 min(或经验证的离心方法回收率达70%以上)弃上清液，等体积重悬沉淀。
(5)沉降法——指抑菌性供试品，当其在水中溶解度较小时，可先按常规方法称量，加规定量的稀释剂制成混悬液，静置数分钟，使难溶于水的抑菌成分自然沉降在容器底部，再吸取上清液检验。
(6)方法综合运用——以泛捷复混悬剂为例，经稀释法﹑中和法﹑薄膜过滤法综合处理供试品后进行需氧菌及控制菌的方法验证，其中青霉素酶单位为每毫升1 000万单位。在需氧菌计数试验组中，其操作步骤为：
① 用0.9%生理盐水把于30~35℃培养18~24 h得到的大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至每毫升含菌量为10~100个。
② 称取10 g样品至90 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液中，振摇使样品分散，从中吸取10 ml溶液至无菌离心管中，天平平衡，3 000转/min离心20 min，弃上清液约9 ml，离心管中留1 ml，用9 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液重悬沉淀，薄膜过滤，用100 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液(含10 ml青霉素酶)冲洗2次，在第2次冲洗液中加入1 ml的0.9%生理盐水，其中含菌10~100 cfu，过滤，将滤膜贴于含0.15%青霉素酶的TSA平皿上，于30~35℃恒温培养箱中培养2 d。
在控制菌试验组中，其操作步骤为：
① 用0.9%生理盐水把于30~35℃培养18~24 h得到的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液(作为阴性对照)稀释至每毫升含菌量为10~100个。
② 称取10 g样品至90 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液中，振摇使样品分散，从中吸取10 ml溶液至无菌离心管中，天平平衡，3 000转/min离心20 min，弃上清液约9 ml，离心管中留1 ml，用9 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液重悬沉淀，薄膜过滤，用100 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液(含10 ml青霉素酶)冲洗2次，将滤膜放置于90 ml乳糖肉汤中，加入1 ml的0.9%生理盐水，其中含菌10~100 cfu，振摇混匀，于30~35℃恒温培养箱中培养24~48 h，用接种环从增殖肉汤中挑取部分样品至麦康凯琼脂培养基上，涂开，将其置于30~35℃恒温培养箱中培养36~48 h。
按照上述方法样品制备后，对需氧菌、控制菌进行3次独立的微生物检测方法验证。需氧菌检测方法验证结果如表1所示。而控制菌检测方法验证结果为：试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性对照菌。
由此可见，综合运用稀释法﹑沉降法﹑中和法﹑薄膜过滤法比单独用某种方法效果好，可以有效地消除抑菌性药物中的抑菌成分的干扰，药品中的菌易被检出，从而可以对抑菌性药物进行微生物限度检查。
3 讨论
微生物方法验证通过后，应严格按验证确立的方法进行供试品的微生物检查。药品微生物限度检查方法验证工作是一个极繁琐、复杂、耗时耗材的操作过程，周期长，干扰因素多,控制不当很难达到验证要求和效果。这就要求验证单位必须具有良好的实验环境、实验设施和工作条件，要求实验工作者具有一定的理论基础和工作经验，严格按操作规范进行操作，减少和避免方法验证结果的误差。应使微生物方法验证资料资源共享 ......
2.3.4 控制菌方法验证的结果判断按照2005年版《中国药典》的规定，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
2.4 特殊供试品的制备
由于有些供试品本身的特性，可能含有抑菌成分，对药品中污染的微生物造成损伤或药品本身色泽会掩盖微生物的肉眼检出，造成假阴性。而这些被微生物污染的药品进入人体后，有些微生物会复苏并繁殖，危及人体健康。在实践中，利用供试品与微生物的差异，来降低或消除供试品对药品中微生物的影响，做到准确检定出药品中微生物的含量，是经常采用的方法。具体包括：
(1)培养基稀释法——计数试验采用此法，1 ml分注入几个平皿(≤10个平皿)降低抑菌浓度或减少供试品的色泽。
(2)薄膜过滤法——利用微孔滤膜阻截细菌，以滤除可溶性成分。
(3)中和法——中和剂应对微生物无毒性，与抑菌性成分结合后的产物对微生物亦应无毒性，或有毒性但不能影响待检菌的检出。如β-内酰胺酶较易破坏青霉素和第一代头孢菌素。
(4)离心沉淀法——悬浮于供试液中的药物颗粒及细菌，由于质量不同可用不同的离心速度分离，一般以短时间低速离心沉淀即可使多数药物颗粒集于管底，难溶性抑菌成分便可借以分离，吸取上层大部分供试液，即可减除其中的抑菌成分。但可能有一些吸附在固体颗粒的微生物随着颗粒被处理掉。细菌细胞个体虽小，但其比重略高于水溶液，可用高速离心将菌细胞收集于管底，弃去上层大部分清液，取管底沉淀液做待检菌检查，可避免抑菌成分对检查的干扰。低速离心一般采用500转/min 离心5 min，收集上清液(菌在上清液中)；高速离心一般采用3 000转/min 离心30 min(或经验证的离心方法回收率达70%以上)弃上清液，等体积重悬沉淀。
(5)沉降法——指抑菌性供试品，当其在水中溶解度较小时，可先按常规方法称量，加规定量的稀释剂制成混悬液，静置数分钟，使难溶于水的抑菌成分自然沉降在容器底部，再吸取上清液检验。
(6)方法综合运用——以泛捷复混悬剂为例，经稀释法﹑中和法﹑薄膜过滤法综合处理供试品后进行需氧菌及控制菌的方法验证，其中青霉素酶单位为每毫升1 000万单位。在需氧菌计数试验组中，其操作步骤为：
① 用0.9%生理盐水把于30~35℃培养18~24 h得到的大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至每毫升含菌量为10~100个。
② 称取10 g样品至90 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液中，振摇使样品分散，从中吸取10 ml溶液至无菌离心管中，天平平衡，3 000转/min离心20 min，弃上清液约9 ml，离心管中留1 ml，用9 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液重悬沉淀，薄膜过滤，用100 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液(含10 ml青霉素酶)冲洗2次，在第2次冲洗液中加入1 ml的0.9%生理盐水，其中含菌10~100 cfu，过滤，将滤膜贴于含0.15%青霉素酶的TSA平皿上，于30~35℃恒温培养箱中培养2 d。
在控制菌试验组中，其操作步骤为：
① 用0.9%生理盐水把于30~35℃培养18~24 h得到的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液(作为阴性对照)稀释至每毫升含菌量为10~100个。
② 称取10 g样品至90 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液中，振摇使样品分散，从中吸取10 ml溶液至无菌离心管中，天平平衡，3 000转/min离心20 min，弃上清液约9 ml，离心管中留1 ml，用9 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液重悬沉淀，薄膜过滤，用100 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液(含10 ml青霉素酶)冲洗2次，将滤膜放置于90 ml乳糖肉汤中，加入1 ml的0.9%生理盐水，其中含菌10~100 cfu，振摇混匀，于30~35℃恒温培养箱中培养24~48 h，用接种环从增殖肉汤中挑取部分样品至麦康凯琼脂培养基上，涂开，将其置于30~35℃恒温培养箱中培养36~48 h。
按照上述方法样品制备后，对需氧菌、控制菌进行3次独立的微生物检测方法验证。需氧菌检测方法验证结果如表1所示。而控制菌检测方法验证结果为：试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性对照菌。
由此可见，综合运用稀释法﹑沉降法﹑中和法﹑薄膜过滤法比单独用某种方法效果好，可以有效地消除抑菌性药物中的抑菌成分的干扰，药品中的菌易被检出，从而可以对抑菌性药物进行微生物限度检查。
3 讨论
微生物方法验证通过后，应严格按验证确立的方法进行供试品的微生物检查。药品微生物限度检查方法验证工作是一个极繁琐、复杂、耗时耗材的操作过程，周期长，干扰因素多,控制不当很难达到验证要求和效果。这就要求验证单位必须具有良好的实验环境、实验设施和工作条件，要求实验工作者具有一定的理论基础和工作经验，严格按操作规范进行操作，减少和避免方法验证结果的误差。应使微生物方法验证资料资源共享 ......
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