药用植物刺山柑悬浮培养细胞聚集体理化性质研究(2)
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1.4.2 过氧化物酶的测定采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性[14]。取0.5 g愈伤组织细胞加入磷酸缓冲液，研磨成匀浆，离心，取上清。依次加入以下反应液，2.9 ml 0.05 mol/L磷酸缓冲液液、1.0 ml 2% H2O2 及1.0 ml 0.05 mol/L愈创木酚。以加热煮沸5 min的酶液为对照。反应体系加入酶液后于37℃水浴中保温3 min，470 nm波长下比色，每隔1 min记录一次吸光值，共计5次。然后以每分钟A470变化0.01为1个酶活单位。
1.4.3 丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸分光光度法[15]。取0.5 g愈伤组织细胞，加入5% TCA 5 ml研磨成匀浆，由3 000转/min离心10 min，上清液即为丙二醛提取液；吸取2 ml上清液，加入0.67% TBA 2 ml混合后于沸水浴上加热30 min，冷却后再离心1次。分别测定上清液在450，532和600 nm处的吸光度值，并按公式C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450 算出MDA浓度。
1.4.4 苯丙氨酸解氨酶的测定参阅文献[16]略做修改。取愈伤组织0.5 g, 加7 ml含5 mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液冰浴中研磨, 10 000转/min离心15 min, 取上清液。酶液适当稀释。1 ml酶液加1 ml 0.02 mmol/L 苯丙氨酸、2 ml蒸馏水。对照不加底物，多加1 ml蒸馏水，30℃中保温0.5 h后置于冰浴。用紫外分光光度计在290 nm处进行吸收测定。
1.5 不同大小细胞聚集体的再培养
将分得的三种直径不同的细胞聚集体收集于培养基中重新培养。取54个50 ml的三角瓶，每瓶分装20 ml MS培养基，并接种0.8 g鲜细胞，每种直径的细胞设3组对照，置于22℃光照条件下摇床培养。每隔4 d称取细胞鲜重，1个生长周期后绘制细胞聚集体再生长曲线。
2 结果与分析
2.1 不同大小细胞聚集体的黄酮含量变化
实验结果表明，直径为0~2 mm的刺山柑细胞聚集体中黄酮的含量最高(0 ......
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