地塞米松对兔视神经钳夹伤治疗作用的实验研究(2)
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1.4取材
动物分别于伤后3、7、14 d取材。动物存活到期后，先后用生理盐水和4%多聚甲醛(含5万U肝素)灌注固定，取视神经、视网膜后固定，然后固定于上述固定液中6 h。梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋视神经、视网膜，切片厚3 μm，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，干燥。
1.5 PV二步法免疫组织化学染色
多克隆兔抗Nogo-A抗体(武汉博士德生物公司)，PV免疫组化检测试剂盒(北京中山生物公司)，DAB显色试剂盒(北京中山生物公司)。取各组切片在同一时间进行PV免疫组织化学染色，具体步骤如下：石蜡切片常规脱蜡入水；封闭内源性过氧化物酶：新鲜配制0.3% H2O2-甲醇，室温处理15 min；抗原热修复：将切片放在盛满0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液
(pH 6.0)的小容器中，微波抗原修复(92～98℃)15 min；滴加兔抗Nogo-A(1∶100)，1 h后放入4℃冰箱过夜；滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20～30 min；以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS(pH 7.2)冲洗，2 min×3次。最后用DAB显色：取1 ml双蒸馏水，加DAB试剂盒中1、2、3试剂各一滴，混合后使用，室温下显色1～3 min，显微镜下控制反应时间，蒸馏水冲洗终止反应，乙醇梯度脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。
1.6图像处理及统计分析
LEICA DMIRE2显微镜及摄像系统进行拍照，并计数不同处理组的RGC数(个/mm2)。免疫组化阳性反应物为黄色，用显微分光光度计(LEICA Leitz, MPV-COMBI)进行定量测定，每1例标本选择10个区域，测定其透光度值，经计算机处理得到相应的吸光度值。数值越大，说明免疫组化反应越强。数据以均数±标准差(x±s)表示，应用单因素方差分析比较各组Nogo-A表达的差异。采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计分析(LSD-t检验)。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1地塞米松治疗后存活RGC计数
视神经损伤后3 d ......
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