针刺任脉和督脉对脑缺血大鼠海马星形胶质细胞的影响(2)
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1.2 局灶性脑缺血大鼠模型的建立
取大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉(35 mg/100 g体重)，应用日本制尼龙线(直径0.205 mm)阻断右侧大脑中动脉血流，缺血2 h后再灌注[1]。再灌注后参考Zea Longa神经病学评分[2]评定神经功能缺损。评分为1~4分则表示造模成功，用于实验。
1.3 实验动物电针方法
针刺督脉组、针刺任脉和督脉组大鼠手术后第2天给予针刺，针刺督脉组给予针刺人中、百会穴，针刺任脉和督脉组予针刺承浆、关元、人中、百会四穴，穴位定位参考《实验针灸学》[3]中承浆、关元、人中、百会四穴在大鼠取穴位标记的方法，针刺后加电，疏密波刺激(疏波30 Hz，密波100 Hz)，强度5 V，以身体相应部位出现轻微颤动为准。持续时间为20 min。模型组大鼠于术后第2天将其如其余实验组大鼠般固定于针刺操作台上20 min，并不给予针刺。实验动物分别于术后的第7天、第14天或第28天处死。sham组大鼠予手术分离至颈内动脉，不给予栓塞，于术后第28天处死。
1.4 免疫荧光双标测定
石蜡先脱蜡进水，以10%正常血清作用10 min，阻断切片对蛋白质的非特异性吸附。切片以0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次；切片以3% H2O2，37℃，10 min，灭活内源性过氧化物酶；0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次；1%BSA 37℃，30 min，封闭非特异性抗原；小鼠GFAP单克隆抗体(BSA稀释至1∶1 500)37℃孵育2 min，4℃过夜；切片以0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次；羊抗小鼠IgG-FITC荧光二抗(BSA稀释至1∶400)37℃孵育1 h；切片以0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次；接着将切片以4%多聚甲醛，室温1 h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活；0.01 mol/L PBS洗5次，5 min/次；小鼠NSE单克隆抗体(BSA稀释至1∶800)37℃孵育2 h ......
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