乌司他丁对胃癌细胞c-met基因表达及增殖的影响研究(2)
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞人胃癌细胞株BGC-823细胞由中科院上海细胞生物所细胞库提供。
1.1.2 主要试剂奥沙利铂(L-OHP，江苏恒瑞医药股份有限公司)，乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司)，RPMI 1640(美国GIBCO公司)，小牛血清(浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司)，抗c-met基因蛋白抗体为鼠抗人单克隆抗体(S-19)，酶联免疫吸附试剂盒(Santa Cruz公司)；1:125胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，RNArose Reagent(上海华舜生物工程有限公司)；Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0[宝生物工程(大连)有限公司]，ANGPTL3引物和β-actin引物(上海生物工程技术服务有限公司)。
1.1.3 主要仪器酶联免疫检测仪(美国EL340型)。
1.2 方法
1.2.1 人胃癌细胞培养BGC-823细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液、37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用4 g/L台盼蓝染色后计算细胞存活率，并进行活细胞计数，调整细胞悬液密度为5×104/ml备用。
1.2.2 c-met mRNA表达检测将备用的细胞悬液接种于6孔板中，500 μl/孔，分为空白组、对照组(1 mmol/L、0.5 mmol/L)和乌司他丁组(320 U/ml、160 U/ml)，每组设4个复孔。4 h细胞完全贴壁后加入受试药物，空白组加入RPMI 1640培养液3 ml，对照组培养液中加入L-OHP至终浓度为1 mmol/L(1组)和0.5 mmol/L(2组)，乌司他丁组培养液中加入乌司他丁至终浓度为320 U/ml(1组)和160 U/ml(2组)，分别置于培养箱中培养48 h。按RNArose Reagent使用说明提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法[Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0]检测c-met mRNA表达情况。
c-met引物设计：
正义链 5'-TCTTCTTCCTCGGACTCGCT-3'；
反义链 5'-GGTGTCGTTTGGAGGTGTGT-3'；
引物长度228 bp ......
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