HPLC-MS/MS测定益智合剂中芍药苷的含量(2)
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(A.阴性对照品；B.对照品；C.供试品；D.芍药苷离子裂解扫描图)
(A.Blank sample； B.Chemical reference substance；
C.Sample； D.Produce ion scan MS/MS spectra of paeoniflorin)
2.4标准曲线的制备
精密量取适量对照品贮备液置10 ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为20，50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 μg/L的对照品溶液，分别进样2 μl，按照上述色谱分离条件测定。得到相应的峰面积(A)分别为362，962，1 930，3 831，9 399，18 944，39 494，100 132，用峰面积(A)对浓度(1/C)进行回归分析，求得回归方程A=19.777 0C-55.044 1，r= 0.999 9。实验表明，芍药苷在20～5 000 μg/L范围内线性关系良好。
2.5精密度试验
精密吸取低、中、高浓度(30，200，1 000 μg/L)对照品溶液，重复进样5次，测得其RSD分别为2.75%，0.84%，0.31%(n=5)。
2.6稳定性试验
同一批号供试品溶液分别在配制后0，1，30，60，120 d按进样2 μl，测得RSD为5.38%(n=5)。
2.7重复性试验
精密量取同一批号样品试液6份，同“2.2.1”制备供试液，分别进样2 μl，测得RSD为2.76%(n=6)。
2.8加样回收率试验
精密量取已知含量的同一批号样品液5份，分别精密地加入芍药苷对照品适量，混匀，同“2.2.1”制备供试液，分别进样2 μl，测定其峰面积，计算实测浓度，得到5份溶液所含芍药苷的测定结果，分别计算相应回收率，其结果见表1。
2.9样品溶液含量测定
分别精密吸取2005年制备的10批供试品溶液0.5 ml按照“2.2.1”项处理后，精密吸取上清液0.1 ml，依上述色谱质谱条件测定，可得到这10批样品中芍药苷的浓度，其计算结果见表2。
3讨论
益智合剂中芍药苷的提取方法文献报道有用D-101大孔吸附树脂柱洗脱法、甲醇稀释超声波处理和热回流提取法[2]，本文曾分别用甲醇、乙醇和乙腈作提取剂作对比，发现乙腈提取回收率最高，故选用乙腈为提取剂。
中药制剂中芍药苷的含量测定方法，有文献报道采用HPLC法[4-10]、薄层扫描法[2]和毛细管电泳法[11]，也有采用高效液相色谱-质谱联用检测法[12]。本文曾试用HPLC-UV法，发现芍药苷色谱峰与杂质峰分不开，且检测灵敏度达不到实验要求，故改用高效液相色谱串联质谱检测法。
本文在正离子和负离子模式下对芍药苷进行全扫描以选择适当的分子离子峰和电离方式，发现芍药苷在电喷雾负离子模式MS2 Scan的扫描下形成的[M+HCOO]-m/z 525的丰度最高，因此选择[M+HCOO]-m/z 525作为碰撞诱导解离的母离子；以m/z 525为母离子，在Product scan的扫描模式下进行子离子扫描，可形成质荷比m/z 449,m/z 479和m/z 327等的子离子峰，其中以离子m/z 449的丰度最高，故选择其为定量离子。这些子离子都是由母离子[M+HCOO]-首先失去甲酸分子，得到[M-H]- m/z 479碎片离子，糖的羟甲基继续发生断裂形成特征碎片离子[M-H-CH2O]- m/z 449和[M-H-CH2O-C6H5COOH]- m/z 327的碎片离子峰。在确定芍药苷的母离子和子离子后进行多离子反应监测(MRM)，当参数四级杆停留时间(Dwell)为0.2 s，裂解电压(Fragmentor)为150 V，碰撞能量(Collision Energy)为28时，得到芍药苷的MRM色谱峰丰度最高。
优化液相条件和质谱条件后，方法最低检测限为2 μg/L，低于文献报道[4-12]，且操作简单，方法精密度、重现性、准确度均达到实验要求，可作为测定益智合剂中芍药苷含量的方法。
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