HPLC法测定寒湿痹颗粒中马兜铃酸A
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[摘要] 目的：建立测定寒湿痹颗粒中马兜铃酸A的高效液相色谱的分析方法。方法：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-1%冰醋酸水溶液(55∶45)为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为315 nm，建立HPLC检测方法。结果：马兜铃酸A峰面积与进样量在0.010 2～0.102 5 μg范围内具有良好的线性关系(r=1.000)。平均回收率为99.3%(n=6)，RSD=0.41%。本方法按信噪比为2∶1计算最低检测限为2 ng。结论：该方法简单，可靠，检测限低，重现性好，可用于寒湿痹胶囊中马兜铃酸A的限量检测。
[关键词] 马兜铃酸A；高效液相色谱法；含量测定
[中图分类号] R927.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2008)11(c)-017-02
Determination the content of aristolochic acid A in Hanshibi Granules by HPLC
KANG Dan-hong1, LI Tai-ping2
(1.The Pharmaceutical Department of Dandong First Hospital, Dandong118000, China; 2. The Institute for Drug Control, Dandong118002, China)
[Abstract] Objective: To establish a method for the determination of aristolochic acid A in Hanshibi Granules by HPLC Methods: The column was Agilent Zorbax SB-C18, mobile phase was methanol–1% glacial acetic acid (55∶45).The flow rate was set at 1 ml/min,detection wavelength was set at 315 nm. Resultes: The calibration curve was linear at the range of 0.010 2-0.102 5 μg (r=1.000). The average recovery was 99.3% (RSD=0.41%). The limit of detection of aristolochic acid A was 2 ng. Conclusion: The method is simple and accurate, it can be used for determination of aristolochic acid A in Hanshibi Granules.
[Key words] Aristolochic acid A; HPLC; Determination
寒湿痹颗粒处方中含有附子(制)、白芍、桂枝、当归、细辛、黄芪等12味中药，具有祛寒除湿、温通经络等功效，临床主要用于治疗肢体关节疼痛、风湿性关节炎等症。制剂处方中的细辛含有微量的肾毒性成分马兜铃酸A，而马兜铃酸A可引起很强的肾毒性，因此必须有效地控制药物中的马兜铃酸A的含量，这方面的工作已有很多报道[1-3]。虽然本制剂在提取过程中以水为溶剂，而马兜铃酸A在水中的溶解度很小，但是为了保证该制剂的安全有效，本文采用高效液相色谱法测定寒湿痹颗粒中的马兜铃酸A，以保证该制剂的安全性。
1仪器与试药
LC-10AVP高效液相色谱仪(附SPD-M10AVP二极管阵列检测器，CLASS-VP色谱工作站，日本岛津)。
马兜铃酸A对照品(中国药品生物制品检定所，批号0746-200103，含量为98.7%)；寒湿痹颗粒(市售制剂，规格为5 g/包，编号分别为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10);甲醇为色谱纯(天津康科德)，冰醋酸为分析纯，水为纯化水。
2方法与结果
2.1检测波长的选择
取马兜铃酸对照品的甲醇溶液，在200～400 nm波长范围内进行扫描。结果表明马兜铃酸在315 nm处有最大吸收，故选315 nm为检测波长。
2.2对照品溶液的制备
精密称取马兜铃酸对照品10.25 mg，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取5.0 ml于100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含马兜铃酸5.125 μg的对照品溶液。
2.3供试品溶液制备
取寒湿痹颗粒约3.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 ml，精密称定，超声提取30 min，放置至室温，补足损失的甲醇，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4系统适应性
色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-1%冰醋酸水溶液(45∶55)为流动相，流速：1.0 ml/min，检测波长为315 nm，柱温为25℃。在该色谱条件下马兜铃酸A的保留时间约为30.0 min。色谱图见图1。
2.5标准曲线
分别精密量取马兜铃酸对照品溶液1.0，3.0，5.0，8.0，10.0 ml置于10 ml量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取上述各液20 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。以对照品进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为Y=868 001X-270.86(r=1.000)，表明马兜铃酸进样量在0.010 2～0.1025 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6最低检测限
取马兜铃酸对照品溶液，以流动相逐步稀释，并按信噪比为2∶1计算最低检出量为2 ng。
2.7准确度试验
精密称取已知不含马兜铃酸的样品6份，每份各约3.0 g，精密称定，置索氏提取器中，精密加马兜铃酸A(5.125 μg/ml)的对照品溶液10 ml，按供试品溶液制备方法同法操作并测定，按外标法计算，结果见表1 ......
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