接骨宝对实验性骨折愈合过程中BMP-2表达的影响(2)
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1.2.2 给药方法接骨宝组造模后第2天开始按2.5 mk/(kg·d)标准喂服给药；对照组只喂以白开水，不服用任何药物。实验动物均在同一实验室条件下用同样方法以普通饲料由专门技术人员饲养和管理。
1.3 标本取材
术后1、2、3、4、5周，从接骨宝组和对照组分别随机抽取4只兔子，处死后取样。取样时均截取右侧桡骨，包括原骨折断端及远近端各长约1.5 cm的正常骨质，并剔除其上的软组织。
1.4 组织学标本制备
标本经4%多聚甲醛溶液固定、EDTA脱钙、石蜡包埋、切片。每组隔3张抽出1张进行苏木精-伊红(HE)染色，即切片经脱蜡脱水、HE染色后进行组织学观察；余下切片进行免疫组化BMP-2染色。
1.5 免疫组化检测
参照BMP-2免疫组织化学试剂盒的操作方法进行免疫组化染色。用0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，染色结果为阴性，细胞染色中出现黄褐色为阳性反应，每次染色均作对照。染色切片经显微镜放大400倍，每例随机摄取骨痂组织图像5幅。每批和批间输入的图像入射光强度皆严格控制在同一水平。通过与计算机相连的显微镜，将采集到的免疫组化切片图像存入微机，用病理图像分析系统进行分析。通过彩色分割方法，分割骨痂图像中BMP-2阳性产物区域，求出阳性产物平均光密度值(代表BMP-2平均着色程度)和阳性产物平均积分光密度(代表BMP-2的含量)。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，以SPSS 12.0统计软件进行统计学处理。组间比较采用t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。2 结果
2.1 HE染色观察
术后1周，两组切片显示以纤维组织为主，可见间充质细胞增殖活跃，内有毛细血管及炎性细胞；接骨宝组胶原纤维较多，分化较成熟，对照组胶原纤维较少。术后2周，接骨宝组有大量软骨细胞及成骨细胞，成纤维细胞多呈圆形，成骨细胞较大，细胞外基质生成较多；对照组胶原纤维较多，软骨细胞和成骨细胞数量相对较少，排列稀疏。术后3周，接骨宝组可见较多成骨细胞和骨细胞，排列较整齐致密，可见破骨细胞，对照组成骨细胞、骨细胞数量较少，生长稀疏，排列紊乱。术后4周，接骨宝组可见成熟的骨细胞及板层骨，骨细胞外可见较多破骨细胞，对照组成骨细胞较多，骨细胞数量较少。术后5周，接骨宝组可见内外骨痂已形成桥接，外骨痂数量少，可见致密性骨皮质，骨小梁数量多，顺力线方向排列，可见大量密集、排列整齐的成骨细胞和骨细胞；而对照组骨小梁大部分未形成桥接，未形成与健康骨形态相近的致密性骨皮质，可见成纤维细胞、成软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞(图1A、B，图2A、B)。
2.2 免疫组化染色观察
术后1周，接骨宝组纤维性骨痂中出现BMP-2阳性染色细胞，阳性表达较对照组强。术后2周接骨宝组可见大量阳性染色细胞，阳性表达程度强，染色集中在成骨细胞、骨细胞、软骨基质、间质细胞等；对照组软骨细胞、成骨细胞及周围基质均呈弱阳性表达，且着色明显浅于用药组。术后3周接骨宝组阳性细胞数量多，染色程度较强，对照组阳性细胞数量较前增多，染色程度也增强，两组比较接骨宝组染色强于对照组。术后4周，接骨宝组阳性细胞数量下降，间质细胞减少，阳性染色程度减弱，软骨基质、幼稚软骨细胞、骨痂表面成骨细胞继续呈阳性染色，成熟软骨细胞未见阳性染色，对照组阳性细胞较多，范围较大。术后5周，接骨宝组较前染色细胞数量及范围明显减少，阳性染色程度明显减弱，成熟的骨细胞未见明显阳性染色，对照组呈阳性染色的范围较广，但着色较浅，可见着色的软骨细胞、成骨细胞等。在全部切片中骨痂局部BMP-2浓度最高，正常骨组织未见明显的阳性染色。纵向比较，接骨宝组术后染色呈先强后弱，术后染色高峰出现在术后2周，对照组也呈先强后弱，但术后染色高峰出现在术后3周。横向比较，接骨宝组阳性染色均较对照组强，尤其在第1、2周。阳性产物平均光密度值和阳性产物平均积分光密度见表1、2。
3 讨论
自20世纪60年代末Urist等提出骨诱导学以来，骨生长因子在骨折愈合中的作用受到越来越多学者的重视。研究表明，骨形成蛋白(BMP)是一种直接影响骨折愈合时间和愈合质量的最关键的细胞因子之一。骨形成蛋白(BMP)是转化生长因子-β(TGF-β)家族中的一组多功能细胞因子，主要由成骨细胞分泌，具有诱导间充质细胞、骨髓基质细胞、骨膜细胞迁徒、增殖、分化成软骨细胞及成骨细胞，导致软骨、骨形成的作用。BMP是决定间质细胞向软骨细胞分化的决定性因素，其中BMP-2是公认的最主要的骨形成调控因子[2]，体内、外实验都证明BMP-2有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，实验也发现BMP-2可以直接作用于成熟的破骨细胞来诱导其吸收活性[3]，可以说BMP-2参与了骨形成的各个阶段，即趋化期、分化期、骨质形成期和重塑期。因此，研究BMP-2在骨折折愈合过程中的表达是研究骨折愈合机制的一个重要途径。
在本实验中，接骨宝组与对照组在骨折愈合的过程中，BMP-2的表达具有一定的相似性，即骨痂局部BMP-2浓度最高，表达趋势均为先增高，随后慢慢减退，推测与骨折愈合中细胞的变化相关，符合正常骨折愈合的变化规律。一般骨折后1周，属纤维骨痂阶段，骨痂主要由成纤维细胞组成，这时只有骨内外膜成骨细胞合成BMP，且成骨细胞功能不活跃，故骨痂局部有BMP表达但浓度低；第2、3周逐步进入软骨成骨阶段，随着毛细血管增生，骨痂局部血液循环改善，这时软骨基质的内皮细胞和间充质细胞增殖分化成为成骨细胞，并形成早期骨小梁，由于成骨细胞功能特别活跃，故此时合成BMP最多，阳性表达最强。第4、5周已转入骨痂修复及塑形期，骨小梁及板层骨已逐步构建完毕，成骨细胞功能逐渐减弱，大量新生骨小梁生长活动明显减少，成骨过程趋于结束，随之出现的是破骨细胞功能的活跃，故此时合成BMP减少，但仍有阳性表达。
对本实验结果作进一步分析，发现两组存在明显不同的地方：接骨宝组的BMP-2高峰出现在骨折后2周，而对照组出现在骨折后3周，且BMP-2出现高峰后，接骨宝组的BMP-2阳性染色衰减速度快于对照组；此外，在整个过程中，接骨宝组BMP-2阳性表达程度均较对照组强。总的来说，接骨宝组呈现BMP-2表达的数量较正常强，表达峰值的时间较正常早，表达衰减的时间较正常缩短的趋势。由此推测，接骨宝对BMP-2的合成、分泌、分布和衰减具有一定的干预作用，并能改变其表达时间及表达量，从而促进了骨折愈合的质量和缩短了骨折愈合的时间。提示治疗骨折时可以采取适当的措施如服药等，以促进内源性BMP-2的合成、分泌；也提示治疗骨折时应早期及连续用药，以便早期即能促进BMP等生长因子的合成和分泌，保证BMP等生长因子在整个骨折愈合过程中发挥更为积极的作用。
从切片中也观察到BMP-2在骨折愈合不同阶段是由不同的细胞进行表达的，表达后其分布也随着不同的组织学变化而变化。
中医学认为，肾藏精主骨生髓，骨骼的生长、发育及坚固有赖于肾中精气的滋养，填精生髓，可强筋壮骨，促进骨折愈合。接骨宝口服液主要由熟地、续断、骨碎补、淫羊藿、龙骨、牡蛎等药物精制而成 ......
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