幽门螺杆菌感染、端粒酶表达与胃癌相关性分析
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[摘要] 目的：探讨幽门螺杆菌(Hp)感染与端粒酶表达在胃癌发生、发展过程中的关系及临床意义。方法：应用端粒酶反复扩增法(TRAP)进行端粒酶活性检测。应用快速尿素酶试验和病理组织学Giemsa染色法检测Hp，两种方法均阳性即可诊断Hp感染。结果：胃癌组织、萎缩性胃炎、浅表性胃炎中，Hp感染阳性率分别为66.6%、43.3%、35.0%，差异无显著性(P>0.05)；而端粒酶表达阳性率分别为89.5%、36.6%、10.0%，差异有显著性(P<0.05)。胃癌组Hp阳性者发生端粒酶阳性的危险性是Hp阴性者的6倍，差异有显著性(P<0.01)；萎缩性胃炎组OR=0.3，差异无显著性(P>0.05)；浅表性胃炎组OR=0，差异有显著性(P<0.05)。结论：Hp与端粒酶阳性检出率随病变加重而增加，Hp感染在诱导端粒酶活性、导致癌变中可能起着重要作用。
[关键词] 幽门螺杆菌；端粒酶；胃癌
[中图分类号] R735.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)01(c)-027-02
大量的流行病学和病理组织学资料表明，幽门螺杆菌(Hp)感染在胃癌的形成过程中具有重要作用。以往的研究证明，Hp感染促进胃黏膜上皮细胞增生，但对其促进胞增殖机制的阐明尚在研究之中[1]。近年来国内外有资料[2-3]表明恶性肿瘤细胞端粒酶活性阳性率为85%～90%，这说明端粒酶激活与恶性肿瘤发生也密切相关。为了进一步探讨Hp感染、端粒酶活性与胃黏膜病变的相关性，我们检测了人胃癌、萎缩性胃炎及浅表性胃炎胃黏膜标本端粒酶活性，并对酶活性及粘膜病变与Hp感染的相关性进行了分析。
1材料与方法
1.1组织标本
232例标本分别取自我院胃癌、萎缩性胃炎及浅表性胃炎患者，所有病例均经病理组织学证实。胃癌132例按日本胃癌分类标准：早期胃癌8例，中晚期胃癌124例；有淋巴结转移44例，脏器转移20例；男112例，女20例，平均年龄57.2岁。萎缩性胃炎60例，男34例，女26例，平均年龄57岁。浅表性胃炎40例，男4例，女36例，平均年龄34.2岁。胃癌组内镜或手术取癌组织8～10块。萎缩性胃炎组及浅表性胃炎取胃窦大、小弯各3块，以上标本分别作端粒酶活性、病理组织学及Hp检测。端粒酶标本置无菌试管中，-80℃冻存。三组的年龄、性别等临床资料均无明显差异。
1.2组织提取物的制备
冰冻组织块50～100 mg液氮研磨，用冰缓冲液[10 mmol/L N-双(2-羟乙基)哌嗪-N′2-(乙磺酸)-KOH(pH 8.0)，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCL，1 mmol/L二硫苏糖醇]清洗后，加100 μl裂解液[10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 7.5)，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L乙二醇-双-(2-氨乙基)四乙酸，5 mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5% 32-(3-胆胺丙基)二甲基氨-1-丙烷磺酸酯，10%甘油]，0℃放置30 min，13 500 rpm 4℃离心30 min收集上清，用Folin-酚法测定蛋白浓度，其余上清分装，-80℃保存待测。
1.3端粒酶活性检测
应用TRAP法进行端粒酶检测，取5 μg蛋白含量的提取液，加入反应液[20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 8.3)，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L乙二醇-双-(2-氨乙基)四乙酸，0.005%吐温-20，50 μmol/L三磷酸脱氧核糖核酸，1 μg T4基因32蛋白，0.2 μg TS引物(5′-AATCCGTC-GAGCAGAGTT-3′)]混匀后20℃保温30 min完成端粒酶介导的延伸反应，90℃ 3 min终止反应后，加入cx引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTT-ACCCTTA-3′)和2 U Taq酶，混匀后覆盖液体石蜡进行PCR扩增[2]。循环参数为94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，循环35次；最后72℃延伸5 min。以已知端粒酶阳性的组织作为阳性对照，以裂解液作为阴性对照。取12 μl PCR产物进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，干胶器干胶后保存。
1.4 Hp检测
Hp检测应用快速尿素酶试验和病理组织学Giemsa染色法，以上两项均为阳性定为Hp感染。
1.5统计学分析
采用χ2检验。
2结果
2.1不同胃黏膜标本Hp感染及端粒酶活性检测
40例浅表性胃炎，60例萎缩性胃炎及132例胃癌标本的Hp感染检测结果显示，其阳性率分别为35.0%、43.3%及66.6%，差异无显著性(P>0.05)。相应组织的端粒酶活性检出率分别为10.0%、36.6%及89.5%，差异有显著性(P<0.05)。
2.2不同黏膜标本端粒酶活性与Hp感染的相关性
在无Hp感染者中，浅表性胃炎、萎缩性胃炎及胃癌的端粒酶检出率分别为0、23.5%及81.8%，而在Hp感染者中则分别为28.6%、53.8%及93.0%，显示Hp感染者中端粒酶阳性率分别比未感染者高。胃癌组OR=6，Hp阳性者发生端粒酶阳性的危险性是Hp阴性者的6倍，差异有显著性(P<0.01)；萎缩性胃炎组OR=0.3，差异无显著性(P>0.05)；浅表性胃炎组OR=0，差异有显著性(P<0.05)(表1)。但不论Hp感染与否，端粒酶阳性率均随病变加重而增加。另外，浅表性胃炎胃黏膜4例端粒酶阳性者均有Hp感染。萎缩性胃炎、胃癌组端粒酶阳性者，亦大部分是Hp感染者(>60%)。
表1 Hp感染与端粒酶活性表达组间比较(例)
3讨论
本文对132例胃癌标本端粒酶活性检测结果表明，其阳性率接近90%，与近年国内外报道的恶性肿瘤细胞端粒酶活性阳性率为85%～90%的水平一致，再一次说明端粒酶激活与恶性肿瘤的密切关系[4-5]。端粒酶活性检测是恶性肿瘤诊断、预后判断的灵敏指标，为其作为抗癌的有效指标提供了临床依据。近年许多研究指出，胃黏膜病变与Hp感染有一定的相关性，Hp已被世界卫生组织认定为Ⅰ类致癌因子。Hp产生的多种毒力因子对胃粘膜上皮具有损伤作用，使上皮细胞增殖与凋亡失衡，最终导致胃癌发生[6]。Hp感染与p53基因突变有非常显著的相关性[7]。石巍等[8]的研究结果发现，Hp感染可能诱使抑癌基因出现甲基化，导致p16基因丧失抑癌活性，因而促进胃癌的发生和发展。我们的结果显示：随着癌前病变的进展，Hp感染率有明显增加，其次，端粒酶阳性率随病变加重而增加，提示端粒酶在黏膜病变的启动及发展中起关键作用。另外，感染Hp的正常胃黏膜有端粒酶活性检出，检出率在有Hp感染的病变组织中比无Hp感染的标本中高，端粒酶阳性标本中大部分有Hp感染。统计学分析表明，Hp阳性者发生端粒酶阳性的危险性是Hp阴性者的6倍，端粒酶激活与胃癌发生密切相关，因而Hp感染者发生胃癌的危险性明显大于Hp阴性者。实验结果亦说明，Hp感染在诱导端粒酶活性、导致癌变中可能起着要作用。本文结果不仅指出 ......
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