葛根素与石杉碱甲改善缺血-再灌注小鼠学习记忆(2)
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1.4 方法
1.4.1 分组及手术将小鼠随机分5组：假手术组(Sham)、缺血-再灌注模型组(I/R)、石杉碱甲400 μg/kg组(Hup-A)、葛根素120 mg/kg组(Pur)及葛根素60 mg/kg+石杉碱甲200 μg/kg联合用药组(Pur+Hup-A)。石杉碱甲按10 ml/kg体重灌胃，葛根素腹腔注射，假手术组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，连续3 d。第3天给药2 h后参照文献[1]方法造模。分离小鼠双侧颈总动脉，夹闭血管20 min，松开10 min，反复3次，第1次缺血同时尾部放血约0.3 ml。保持小鼠肛温于36℃左右。假手术组同上处理，但不夹闭动脉，不放血。
1.4.2 跳台训练将小鼠放入跳台仪，通38 V交流电，记录小鼠第一次逃避到平台上的潜伏期(escape latency)和5 min内触电时间(error time)和触电次数(error frequency)作为学习成绩，如5 min内未跳上平台，潜伏期以300 s计；24 h后测试放于平台上的小鼠第一次跳至铜栅上受电击的潜伏期(step down latency)及3 min内错误时间和错误次数，作为记忆成绩。测试时，若小鼠在平台上超过3 min，其潜伏期即以180 s计。
1.4.3 细胞凋亡的检测大脑皮层组织取材，置于70%乙醇中固定后制备细胞悬液，加入碘化丙啶(终浓度为100 μg/ml)，4℃避光染色30 min，过滤后进行流式细胞仪检测，应用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期进行拟合分析。测定细胞周期各期的DNA含量，得出凋亡细胞所占的比例。
1.4.4 单胺类递质及其代谢产物含量测定样品制备及测定：皮层组织称重后立即加入冷0.4 mol/L高氯酸溶液中匀浆，离心15 min，吸取上清液，再加入1/2体积的钾离子缓冲液，混匀后于冰浴中放置10 min，再离心10 min，取上清液20 μl进样于HPLC，用电化学检测器测定，内标法定量，峰面积计算含量。色谱条件：泵流量0.9 ml/min；电化学检测器工作电压：+0.76 V。流动相：0.1 mol/L柠檬酸；0.1 mol/L醋酸钠，pH 3.7，内含15%甲醇；1.2 mmol/L辛烷基磺酸钠；1.3 mmol/L二正丁胺。
1.5 统计学方法
数据以“均数±标准差”(x±s)表示，采用方差分析和q检验分析。
2 结果
2.1 跳台实验
由表1和表2可知，I/R组学习记忆各项成绩均差于Sham组；各给药组都可提高I/R小鼠的学习记忆成绩，其中，Pur组及Pur+Hup-A组的成绩好于Hup-A组，Pur+Hup-A组成绩最好。
表1 葛根素和石杉碱甲对缺血-再灌注小鼠学习成绩的影响(x±s)
Table 1 Effect of Puerarin and Huperzine A on learning behavior of dementia mice induced by ischemia-reperfusion in step down test (x±s)
Compared with Sham group, ##P<0.01, ###P<0.001; compared with I/R group, **P<0.01, ***P<0.001; compared with Hup-A group, △P<0.05
表2 葛根素和石杉碱甲对缺血-再灌注小鼠记忆成绩的影响(x±s)
Table 2 Effect of Puerarin and Huperzine A on memory behavior of dementia mice induced by ischemia-reperfusion in step down test (x±s)
Compared with Sham group, ##P<0.01, ###P<0.001; compared with I/R group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; compared with Hup-A group, △P<0.05, △△P<0.01
2.2 大脑皮层细胞凋亡
与Sham组比较，I/R组小鼠大脑皮层细胞DNA在细胞周期G0/G1期前的亚G1期含量明显增加，说明细胞凋亡率明显升高。各给药组都可减少细胞凋亡，Pur+Hup-A组作用优于Hup-A组(P<0.05)，见表3。
表3 葛根素和石杉碱甲对缺血-再灌注小鼠大脑皮层细胞凋亡的影响(x±s，n=5，%)
Table 3 Effects of Puerarin and Huperzine A on neuron apoptosis in cerebral cortex of ischemia-reperfusion mice(x±s，n=5，%)
Compared with Sham group, ###P<0 ......
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