免疫抑制剂FTY720对小鼠肝移植瘤抑制作用的研究(2)
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[Key words] Immunosuppression; Antitumor activity; FTY720; Bcl-2; Caspase-3
原发性肝癌(HCC)是世界范围内一种常见的恶性消化道肿瘤之一，其恶性程度高，发展迅速，病死率高。对于进展期肝癌，特别是不能手术切除者，肝移植是生存的唯一机会。肿瘤的复发和转移以及免疫排斥是肝癌肝移植后两大难题。
FTY720是冬虫夏草分离出的活性成分ISP-1[1]，经去除手性中心，改变侧链得到的氨基丙二醇化合物[2]，目前主要用于抑制器官移植所引起的排斥反应[3]，有研究发现，它可用于治疗某些原发性及转移性癌症[4]。本实验对FTY720对小鼠免疫抑制及抗肝移植瘤作用进行研究，从而为临床治疗肝癌后肝移植提供理论基础和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物与细胞株：实验动物为4周龄雌性清洁级(SPF)C57BL/6j小鼠，购自北京中科院试验动物中心，饲养于山西医科大学试验动物中心。Hepa1-6肝癌细胞购自中国科学院。
主要试剂：FTY720(南京安格医药化工有限公司)，RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司)，兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体(编号BAO412，批号20081003)、兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体(编号BAO588，批号20081003)、凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 模型建立Hepa1-6细胞传代3～4次后，取指数生长期细胞，PBS重悬，浓缩为2×107/ml，按0.1 ml/只的量接种于C57BL/6j小鼠腰胁部皮下。当C57BL/6j小鼠移植瘤直径至0.30 cm，将40只成瘤小鼠随机分为4组，分别做如下处理，环孢素组：环孢素10 mg/(kg·d)灌胃；FTY720组：FTY720 3 mg/(kg·d)灌胃[3 mg/(kg·d)为FTY720作为免疫抑制剂的常用剂量[5]；5-Fu组：5-Fu 50 mg/(kg·d)灌胃；生理盐水组：0.9%氯化钠注射液1 mg/(kg·d)灌胃。连续灌胃10 d，给药结束次日处死小鼠，剥离瘤体。
1.2.2 外周血T淋巴细胞百分比测定连续给药10 d，于末次给药后1 h，剪鼠尾取血涂片，自然干燥后，浸入37℃孵育液(已预热30 min)中孵育3 h，自来水冲洗，加1%孔雀绿溶液染色8 s，自来水冲洗，晾干后油镜检查，每只小鼠血涂片标本均查100个淋巴细胞，计算T淋巴细胞的百分比。
1.2.3 胸腺、脾指数测定连续给药10 d，末次给药后次日称重，麻醉下眼眶放血处死，剥取胸腺、脾，电子天平称重，计算胸腺(脾)指数=[胸腺(脾)重量(mg)/体重(g)]。
1.2.4 肿瘤体积测定用游标卡尺测定肿瘤最长径(a)和最短径(b)，以公式V=π/6ab2计算肿瘤体积。
1.2.5 周围血甲胎蛋白(AFP)测定处死前，采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。
1.2.6 原位细胞凋亡检测参照TUNEL检测说明书，组织切片逐级脱蜡，水化，蛋白酶K消化后，分别与TUNEL反应混合液及转化剂POD 37℃孵育，DAB显色，对比染色，脱水、透明后封片观察。实验同时设阳性和阴性对照，普通光镜下观察，随机选取5个高倍视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比，作为凋亡指数(apoptosis index，AI)。
1.2.7 免疫组化SABC法检测Bcl-2和Caspase-3切片常规脱蜡至水，滴加3% H2O2室温10 min，蒸馏水洗3 min×3次，微波修复抗原，滴加5% BSA血清封闭液，室温20 min，滴加一抗(兔抗鼠Caspase-3、Bcl-2 IgG)，37℃孵育120 min，PBS洗2 min×3次，滴加二抗(生物素标记山羊抗兔IgG)，37℃孵育20 min，PBS洗2 min×3次，滴加试剂SABC，37℃反应20 min，PBS洗5 min×4次，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。在100倍光学显微镜下观察，随机选择5个视野，采用JEOA801D 610图像分析软件测定阳性细胞的平均光密度(OD)值。
1.3 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，组间数据比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析
参加实验的40只小鼠全部进入结果分析，没有脱失。
2.2 各药物组小鼠胸腺、脾指数以及外周血T淋巴细胞百分比的检测
见表1。
表1 各药物组对小鼠胸腺、脾指数以及外周血
T淋巴细胞百分比的影响(x±s)
与生理盐水组比较，aP<0.05，bP<0.01
表1结果表明，与生理盐水组比较，环孢素组和FTY720组可显著降低小鼠胸腺及脾指数，降低小鼠外周血T淋巴细胞百分比，差异有显著性；而5-氟尿嘧啶组差异无显著性。
2.3 各药物组小鼠瘤体体积、甲胎蛋白及凋亡指数的检测
见表2、图1。
表2 各药物组对小鼠瘤体体积、甲胎蛋白、凋亡指数的影响(x±s)
与生理盐水组比较，aP<0.05，bP<0.01
图1各药物组对小鼠瘤体体积的影响
(A：生理盐水组；B：5-氟尿嘧啶组；C：环孢素组；D：FTY720组)
以上结果表明，与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组和FTY 720组可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性；而环孢素组差异无显著性。
2.4 各药物组小鼠瘤体Bcl-2及Caspase-3表达的检测
见表3、图2。
表3 各药物组对小鼠瘤体Bcl-2及Caspase-3表达的影响(x±s)
与生理盐水组比较，aP<0.05，bP<0.01
图2 各药物组对小鼠瘤体Bcl-2表达的影响
(A：生理盐水组；B：5-氟尿嘧啶组；C：环孢素组；D：FTY720组；SP×400)
以上结果表明，与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组和FTY20组可显著降低Bcl-2的表达，差异有显著性；而环孢素组差异无显著性。与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组可显著降低Caspase-3的表达，差异有显著性；而FTY720组和环孢素组差异无显著性。
3 讨论 ......
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