吗替麦考酚酯分散片在中国健康男性志愿者体内的药动学和生物等效性研究(2)
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1 材料与方法
1.1 仪器
美国Agilent 1100液相色谱仪，配备G1313A自动进样器和G1315B二极管阵列检测器；TGL16M台式高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)；XW280A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；AG285电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。
1.2 药品和试剂
试验制剂(T)为湖南华纳大药厂研制的吗替麦考酚酯分散片；参比制剂(R)为上海罗氏制药有限公司生产的吗替麦考酚酯胶囊(商品名骁悉)，两者规格均为250 mg。吗替麦考酚酯对照品(湖南华纳大药厂，含量99.4%)，内标普罗帕酮(山东莒南制药有限公司，含量99.2%)。甲醇、乙腈(色谱纯，Tedia公司)，醋酸铵等其他试剂均为国产分析纯，水为双重蒸馏水。空白血浆由中南大学湘雅二医院血液科提供。
1.3 受试者选择
20名健康男性志愿者，平均年龄(22.8±1.15)岁，体重(64.5±5.53) kg，身高(172±4.12) cm；受试前经询问病史、体格检查和实验室检查未发现异常。受试者既往体健，无药物过敏史，无吸烟、嗜酒及经常用药史。试验前2周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物。受试期间统一清淡饮食，不使用除试验(参比)制剂以外的任何药物，不接受烟、酒及含咖啡的饮料，避免剧烈运动。受试者试验前签署知情同意书，本试验方案经医学伦理委员会审核批准。
1.4 给药方法与样品采集
采用双周期自身随机交叉试验设计。20名受试者随机等分为A、B两组，每组受试者每次试验时分别服用试验制剂或参比制剂。受试者于试验前1 d晚餐后，禁食、不禁水12 h，次日清晨空腹分别单次口服1 g吗替麦考酚酯试验制剂和参比制剂，以250 ml温开水送服，并作记录。服药2 h后可自由饮水，服药4 h后进统一低脂肪、低蛋白标准餐。试验期间由医护人员进行监护。分别于服药前(0h)和服药后0.25，0.50， 0.75，1.00，1.50，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00，24.00 h由前臂肘静脉取血5 ml。经过7 d洗脱时间后交叉给药，同时间点取血。血样置于含有肝素的离心管中，立即离心(3 000 r/min)10 min，分离出血浆，置-20℃冰箱中保存备测。
1.5 血浆样品处理与血药浓度测定
1.5.1 色谱条件色谱柱：Kromsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶乙腈∶水(10 mmol/L醋酸铵调pH至5.0)＝25∶35∶40(V/V/V)；流速：1.0 ml/min；紫外检测波长：303 nm；进样量：20 μl；柱温：35℃。
1.5.2 血浆样品的处理精密吸取200 μl血浆，加入400 μl乙腈配制的25 μg/ml普罗帕酮内标溶液，涡流混合1 min，13 000 r/min离心10 min，得上清液400 μl，取20 μl进样。
1.6 线性范围及定量下限
用空白血浆将标准储备液稀释成不同浓度的混合液，按“1.5.2”项下方法操作，每一浓度进行3样本分析，进样20 μl，记录色谱图；以待测物浓度(X)为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值(Y)为纵坐标，用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算[13]，得麦考酚酸线性范围为：0.40～51.50 μg/ml，回归方程为：Y＝0.043 9X+0.022 6，r=0.999 5，定量下限为:0.20 μg/ml。
1.7 方法学考察与评价
1.7.1 色谱行为空白血浆、吗替麦考酚酯血浆标准以及健康受试者血浆样品，经HPLC分析测定得到的色谱图见图1。麦考酚酸和内标普罗帕酮的保留时间分别为5.4 min和7.5 min左右；空白血浆中的内源性物质不干扰麦考酚酸和内标普罗帕酮的测定。
1.7.2 准确度与精密度取空白血浆200 μl，按“1.6”项下的方法配制吗替麦考酚酸低、中、高三个浓度(0.80、6.44、51.50 μg/ml)的质控(QC)样本，每一浓度制备6个样品，当天进样分析，连续测定3 d，根据当天的标准曲线计算QC样本的测得浓度，并与理论浓度对比，计算测定方法的准确度及日内和日间精密度。结果得吗替麦考酚酸在血浆浓度为0.80、6.44、51.50 μg/ml时的测得量分别为0.81、6.57、52.79 μg/ml，日内RSD分别为6.08%、3.24%、2.43%，日间RSD分别为6.02%、4.43%、2.50%，符合生物等效性研究的方法学要求。
1.7.3绝对回收率取空白血浆200 μl，按“1.6”项下的方法制备麦考酚酸低、中、高三个浓度(0.80、6.44、51.50 μg/ml)的样品，每一浓度进行6样本分析，计算样品峰面积(As)和内标峰面积(Ai)的比值fx(fx=As/Ai)。另于相应浓度、不加空白血清的麦考酚酸溶液中加入内标测定，得fs(fs=As′/Ai′)。求fx和fs的比值，即可得到绝对回收率。结果得麦考酚酸在血浆浓度为0.80、6.44、51.50 μg/ml时的绝对回收率分别为(75.35±3.87)%、(80.21±2.35)%和(81.33±1.60)%，内标的绝对回收率为(65.79±1.91)%。其绝对回收率基本一致，表明测定数据精密，可重现。
1.7.4 稳定性试验考察吗替麦考酚酸血浆样品经历3次冷冻(-20℃)-解冻(室温)循环、室温放置24 h、-20℃存放20 d以及处理后的血浆样品室温放置24 h的稳定性。取空白血浆200 μl，配制相当于吗替麦考酚酸浓度0.80、6.44、51.50 μg/ml的血浆样品，每一浓度水平进行3样本分析测定。结果显示，所有室温放置试验、冰冻和冻融试验的测定值与添加值的相对偏差(RE)均小于15%，说明分析测试过程中的样品较为稳定。
1.8 数据处理
利用DAS Ver 2.0统计软件计算药动学参数，Cmax和tmax均以实测值表示。AUC0-t以梯形法计算；AUC0-∞按公式计算：AUC0-∞＝AUC0-t+Ct/λZ(t为最后一次可实测血药浓度的采样时间；Ct为末次可测样本药物浓度；λZ为对数血药浓度-时间曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数)；t1/2用公式t1/2＝0 ......
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