直肠癌中MMP-7和MVD的表达及其与肿瘤转移和预后的相关性研究(2)
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1.2 方法
全部标本均经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋组织，切片；常规脱蜡至水，3% H2O2去离子水孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶；PBS冲洗，滴加血清工作液，室温孵育15 min(非特异性抗原封闭)；滴加一抗，4℃冰箱过夜。同时用已知的乳腺癌MMP-7阳性组织作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。PBS洗3次，滴加二抗，室温30 min，PBS洗3次，DAB显色，蒸馏水终止，苏木素复染，脱水和透明，封固阳性信号在细胞质呈棕褐色颗粒状均匀分布。
1.3 结果判定
MMP-7判定标准：光镜下观片，在高倍镜视野(×400)下计数，按其阳性细胞分布范围判定，阳性细胞少于切片中肿瘤细胞的25%者判定为(-)；26%~50%记为(+)；51%~75%记为(++)；≥76%记为(+++)。MVD(用CD34进行标记)判断标准：采用Weidner[2]的评判标准，计算直肠癌间质内着色的毛细血管和微小血管。计算方法：每张染色切片选择5个血管最多的癌间质区，在100倍视野下进行血管计数，每例标本计数5个视野，取其平均值。
1.4 统计学处理
用SPSS 15.0统计软件对MVD的表达进行成组资料t检验、MMP-7的表达进行?字2检验及生存率比较进行时序检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MMP-7和MVD在直肠癌组织和正常直肠组织中的表达
MMP-7在直肠癌中的表达位于癌细胞的胞质，呈棕褐色、颗粒状。阳性细胞在癌巢中分布不均匀，常位于癌巢周边区域；在对照组组织的表达位于间质血管内皮细胞、成纤维细胞及巨噬细胞胞质内，MMP-7在直肠癌及对照组的阳性表达率分别为76.2%(32/42)及33.3%(6/18)，两组比较，有非常显著性差异(P<0.01)；MVD免疫组化染色，CD34表达位于直肠癌间质血管内皮细胞胞质，呈棕褐色颗粒。直肠癌及对照组CD34阳性表达分别为(43.50±11.80)及(23.83±4.88)，两组比较，有非常显著性差异(P<0.01)。
2.2 MMP-7和MVD与直肠癌临床病理特征的关系
直肠癌有无淋巴结转移对于MMP-7阳性表达的差异没有统计学意义(P>0.05)，分化程度对于MMP-7阳性表达的差异也没有统计学意义(P>0.05)；但有淋巴结转移的直肠癌患者的MVD阳性表达高于无淋巴结转移组(P<0.01)；MVD阳性表达在不同分化程度有显著性差异(P<0.05)，见表1。
2.3 MMP-7对直肠癌MVD的影响
MVD在MMP-7阳性和MMP-7阴性直肠癌组织的表达分别为(43.89±11.87)和(26.73±8.90)，两组比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
2.4 MMP-7和MVD在直肠癌患者中的表达与患者生存率的关系
直肠癌患者在MMP-7阴性表达组和阳性表达组的平均生存时间分别为(59.80±5.68)个月和(37.59±3.70)个月，经时序检验，两组的生存率差别有统计学意义(P<0.05)，生存率曲线见图1。直肠癌患者在CD34表达>50和≤50两组的平均生存时间分别为(20.27±4.29)个月和(51.48±3.56)，经时序检验，两组的生存率差别有统计学意义(P<0.001)，生存率曲线见图2。
3 讨论
3.1 MMP-7的表达与直肠癌发生、发展、浸润及转移的关系
肿瘤的发生、发展是多种因素参与、多步骤的复杂过程。转移和浸润是恶性肿瘤最重要的生物学特征，其过程复杂，机制尚不完全清楚。基质金属蛋白酶通过降解细胞外基质及基底膜在肿瘤的浸润和转移中起重要作用[3]。本文所研究的MMP-7蛋白(又称matrilysin)主要是发挥降解作用，肿瘤组织MMP-7的表达增强参与了解基底膜和细胞外基质胶原蛋白，使肿瘤细胞易于突破基底膜和细胞外基质向邻近器官浸润，并侵入淋巴管及小血管向远处转移。本实验显示，直肠癌的MMP-7阳性表达率明显高于对照组，但直肠癌有无淋巴结转移对于MMP-7阳性表达的差异没有统计学意义(P>0.05)，分化程度对于MMP-7阳性表达的差异也没有统计学意义(P>0.05)，证实MMP-7与直肠癌的侵袭关联性不大。本实验结果与有关研究[4-5]的结果有所不同，造成此差别的原因可能是所选取的样本量有所不同，以及种族差异、地方差异等，说明MMP-7在直肠癌的发展、浸润和转移过程中可能发挥了一定的作用，但不是决定或重要作用。
3.2 MVD与直肠癌侵袭转移的关系
本实验中，直肠癌中的MVD值明显高于正常组织；淋巴结转移阳性组中的MVD表达率远高于淋巴结转移阴性组；同时分化较低的黏液癌和未分化癌组MVD值较分化较高的乳头状腺癌和管状腺癌组表达明显高，两组比较，有显著性差异(P<0.05)。而在直肠癌中乳头状腺癌和管状腺癌较黏液癌和未分化癌分化程度好，说明直肠癌组织中的MVD值与肿瘤细胞分化程度及侵袭转移均有一定的关系，肿瘤的MVD值较高者，就有较强的侵袭能力和转移能力，这与李海林等[6]的研究结果相近。
3.3 MMP-7与直肠癌微血管生成的关系
正常条件下成熟个体很少有新生血管生成旺盛现象的发生，只有在受到损伤后炎症修复等条件下才有可能发生，此时也往往伴随MMP-7的产生。MMP-7对病理条件下血管内皮细胞的增生、毛细血管的形成具有促进作用[7]。本研究中MMP-7阳性组直肠癌的MVD值明显高于MMP-7阴性组，表明MMP-7可能促成直肠癌的血管生成。几乎表达过量MMP-7的恶性肿瘤，其血管的生成都较丰富，与肿瘤生长同步。关于MMP-7促成肿瘤血管生成的机制，目前认为有以下两点：①MMP-7降解细胞外基质，为新生血管的生长提供空间，同时，还可产生一些小分子片段作为与肿瘤血管内皮细胞表面受体相结合的细胞因子对血管内皮细胞的生长具有一定的诱导和促进作用。②可促进合成和释放许多调节血管生长的因子，如FGF-R1、TNF-α、VEGF等[8]，提示肿瘤细胞及基质细胞除自身分泌MMPs外，还可以通过分泌促肿瘤血管形成因子间接促进肿瘤新生血管的形成[9]。MMP-7及MVD与直肠癌的浸润转移密切相关 ......
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