雌激素对去卵巢大鼠局灶性脑缺血的保护作用及对Bck-2蛋白表达的影响(2)
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1.3 结果检测
①利用放免方法测定各组大鼠血雌激素浓度。②将固定好的大鼠脑切除额极和枕极，沿视交叉前缘冠状切断,并分别向前、向后将大鼠脑切成3 mm厚的组织块。近额极、枕极的组织块剔除。取视交叉后的第1个组织块自额侧连续切取2张组织片，分别做常规HE染色和Bcl-2蛋白免疫组化检测。其他组织块自额侧切取1张冠状组织片，行HE染色。每张切片厚度均为6 μm。
经HE染色后的组织切片显示的脑组织坏死区为梗死灶。利用病理图像分析系统测出每张HE染色切片中梗死灶的面积，取每只大鼠所有HE染色切片中梗死灶面积之和作为该大鼠的梗死灶面积。
Bcl-2蛋白免疫组化染色采用SABC法。选定显微镜下胞质染色呈棕色者为阳性细胞，于40倍物镜下在每张切片梗死灶边缘取相互不重叠的6个视野，计数其中Bcl-2免疫组化阳性细胞数，取每只大鼠各视野阳性细胞数之和作为该大鼠的阳性细胞值。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差(x±s)表示，对各给药组和缺血对照组脑梗死灶面积、Bcl-2免疫组化阳性细胞值分别作两两比较，进行t检验。对A、B、C、D组每只大鼠血雌激素浓度和Bcl-2阳性细胞值进行直线相关回归分析。
2 结果
2.1 各组大鼠血雌激素浓度
见表1。
表1 各组大鼠血雌激素浓度(x±s，pg/ml)
2.2 各组大鼠梗死灶面积
正常组和假手术组均未见梗死灶。给药各组梗死灶面积与缺血对照组相比较均减小，有显著性差异(P<0.01)。C组梗死灶面积较A组和D组均减小，有显著性差异(P<0.01)。B组与D组比较，梗死灶面积无显著性差异(P>0.05)。见表2。
表2 各组大鼠梗死灶面积(x±s，mm2)
与A组比较，**P<0.01
2.3 Bcl-2蛋白免疫组化检测结果
正常组和假手术组未见Bcl-2蛋白免疫组化阳性细胞。与HE染色对照，Bcl-2免疫组化阳性细胞主要位于缺血梗死灶边缘，梗死灶中心区和远离梗死灶的区域未见阳性细胞，阳性细胞主要是神经元细胞和小胶质细胞，信号主要位于胞质。与缺血对照组相比，给药各组Bcl-2阳性细胞值明显增加，有显著性差异(P<0.01)。C组阳性细胞值较A组和D组均增加，有显著性差异(P<0.01)。B组与D组比较，阳性细胞值略有增加，有显著性差异(P<0.05)。见表3。
表3 脑缺血后各组Bcl-2阳性细胞值比较(x±s,个/10×40视野)
与A组比较，**P<0.01
2.4 各组血雌激素浓度与Bcl-2阳性细胞值的关系
在一定范围内，血雌激素浓度与Bcl-2阳性细胞值呈正相关(r=0.41，P<0.05)。
3 讨论
3.1 雌激素的脑保护作用
雌激素是一种甾体激素，人体内雌激素包括三种：雌二醇、雌酮及其代谢产物雌三醇，其中雌二醇是主要成分，其生物效能也最强。目前许多基础及临床流行病学研究结果支持雌激素水平与缺血性脑血管病之间存在着一定联系。而Alkayed等[7]的研究发现，雌性大鼠MCAO后脑损伤较雄性大鼠轻，梗死面积仅为雄性大鼠的1/3。如雌性大鼠去除卵巢，则梗死面积几乎与雄性大鼠相同。而雌激素替代治疗后可使去卵巢雌性大鼠脑梗死面积明显缩小，提示雌激素在实验性脑缺血损伤中发挥着重要的保护作用。在本实验中，正常组和假手术组大鼠的梗死灶面积为0，而给药各组大鼠MCAO 24 h后梗死灶面积较缺血对照组均减小，差异有显著性，表明雌激素能减轻MCAO后神经组织的损害，对于雄性大鼠具有脑保护作用，也进一步证实了雌激素的脑保护作用，这与Toung等[8]的实验结果一致。
3.2 雌激素脑保护作用的机制
目前，关于雌激素脑保护作用的机制仍在研究之中，尚不十分清楚。学者们普遍认为此机制十分复杂，可能包括基因和非基因等多种因素[9-11]。Bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因，一般位于核膜、内质网和线粒体膜上。它在胚胎时期及生后1周脑内可呈高度表达，之后迅速下降。成年脑内的表达极低，用常规的免疫组化方法一般检测不到，只有在病理状态方可见其表达增高，且主要在幸存细胞中表达。目前研究认为Bcl-2可阻止神经元发生缺血性死亡，这已被过度表达Bcl-2的小梗死灶转基因鼠所证实[12]。在本实验中，正常组及假手术组大鼠脑内无Bcl-2蛋白表达，缺血对照组在MCAO 24 h后梗死灶边缘区有Bcl-2蛋白表达，而给药各组大鼠缺血24 h后的梗死灶边缘区均可见Bcl-2蛋白表达增加，表明雌激素可能通过增加脑内Bcl-2蛋白的表达来抑制细胞的凋亡，从而减轻脑缺血损伤。Dubal等[13]用mRNA逆转录技术对大鼠大脑中动脉缺血模型进行研究发现，雌激素可通过增加脑缺血组织及缺血半暗带Bcl-2蛋白的表达，控制细胞凋亡，缩小梗死区域，且脑皮质雌激素受体(ER-β)的增加与Bcl-2平行，故推断雌激素可能通过与脑缺血皮质ER-β结合使Bcl-2上调，从而发挥其脑保护作用。
3.3 雌激素的最适给药剂量
在对本实验结果进行分析的过程中我们发现：在给予不同剂量的雌激素后，给药剂量为1.0 mg/kg的大鼠脑梗死灶减小最明显，Bcl-2蛋白表达增加也最明显，是各组实验动物中疗效最好的一组，说明雌激素的脑保护作用可以在一个最适浓度时发挥最佳效果，这可能是由于雌激素血药浓度达到一定水平时，使Bcl-2基因表达的增加达到最大极限，从而发挥出最佳脑保护效果。因此，在雌激素的实验性研究中，我们可以选择这一给药浓度，以得到更好的研究效果。
3.4 雌激素浓度与Bcl-2蛋白表达的关系
在本实验中，通过对血雌激素水平与Bcl-2阳性细胞值的直线相关回归分析发现：在一定范围内Bcl-2蛋白表达与血雌激素水平呈正相关，即在一定范围内Bcl-2蛋白的表达随血雌激素浓度的增加而增多，进一步说明雌激素的脑保护作用可能是通过上调Bcl-2蛋白表达来实现的。
总之，雌激素的确切脑保护机制目前尚不十分清楚 ......
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