补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠脑内神经细胞黏附分子表达的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2366KB，3页)。
1.5.4 标本处理大鼠以10%水合氯醛(4.0 ml/kg)麻醉后，一半大鼠沿胸骨左侧剪开胸腔，从左心室进针，插入主动脉，固定针头，剪开右心耳，快速滴入预冷生理盐水(10 ml/min)，无血污后改滴入4%多聚甲醛(5～10 ml/min)，先快后慢，约250 ml，开颅取脑，去额极、小脑，4%多聚甲醛后固定1 h，依次放入15%、20%、30%蔗糖沉底24 h。OTC包埋，冰冻切片机冠状连续切片，15 μm厚，每隔20张取4张切片。
1.6 免疫组化检测
切片放入3%过氧化氢-甲醇溶液中浸10 min灭活内源性过氧化物酶；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加100 μl正常马血清封闭10 min，倾去溶液；加入抗大鼠NCAM抗体(1∶500)，37℃温育1 h，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；加入通用型生物素化二抗10 μl，37℃ 30 min，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；加入过氧化物酶标记链霉卵白素100 μl，37℃ 10 min，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加AEC显色剂10 min，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，65℃ Clearmount封片剂封片。同时用正常山羊血清和PBS代替一抗作空白对照，以检查免疫反应的特异性。
1.7 阳性细胞计数
每只动物取海马部位切片5张，置于100倍物镜下，每张切片随机选取缺血周围区10个视野，用Olympus Micro Image 4.0图像处理系统自动计数免疫阳性细胞数，计算其平均值。
1.8 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 11.0统计软件包对数据进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响
结果见表1。用药7、14 d，补阳还五汤组神经功能记分与模型组比较差异均有显著性(P<0.05)，两组7、14 d与3 d比较，差异有显著性(P<0.05)，结果提示，补阳还五汤能改善大鼠局灶性脑缺血神经功能缺失症状，且随着时间延长，其神经功能缺失症状的改善越明显。
2.2 脑缺血后NCAM阳性细胞的分布规律
NCAM在正常脑组织有少量表达，阳性细胞见于海马区和皮层区，以管状形态为多见。脑缺血后NCAM阳性细胞迅速增加，主要表达于缺血半球大脑皮层和室旁区，缺血中心区有少量表达，对侧半球亦有增加，细胞形态除管状外，可见神经细胞样和条索状(图1)。
图1 各组脑内NCAM表达(×200)
(A1：正常组皮层；B1：模型组皮层；A2：正常组海马；B2：模型组海马；B3：模型组1 d室旁区；C1：治疗组1 d室旁区；B4：模型组3 d室旁区；C2：治疗组3 d室旁区)
2.3 补阳还五汤对脑缺血后NCAM表达的影响
脑缺血后NCAM阳性细胞即开始增加，于缺血损伤后3 d达高峰，随后逐渐下降，但在14 d时仍高于正常水平，模型组与假手术组之间在各时间点NCAM阳性细胞数明显增多，有显著性差异(P<0.01)；补阳还五汤组NCAM阳性细胞与模型组有相似的表达规律，于术后3 d达高峰，且增幅明显提高，两者在7、14 d时间点与模型组比较，有显著性差异(P<0.01)，见图1、表2。
表2 补阳还五汤对脑缺血后NCAM表达的影响(x±s，个/mm2)
与假手术组比较，ΔP<0.01；与同期模型组比较，▲P<0.01
3 讨论
近年来大量研究表明，脑缺血损伤后脑组织具有一定的自我修复能力，中枢神经系统损伤后的神经再生与后期康复效果密切相关[6]，增强损伤脑的神经再生成为目前研究的热点。
神经再生不仅与动物物种、年龄、损伤部位、功能训练和学习等因素相关，还与细胞内外众多因子密切相关，在众多的细胞因子中，神经细胞黏附分子家族尤为重要。NCAM是细胞表面的一种糖蛋白，介导细胞的黏附和识别，在胚胎发育期，NCAM在各胚层均有表达；而在出生后动物中，NCAM的表达主要集中在神经组织中[7]。NCAM突出的生物学功能是和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间的同型识别和黏附，在神经元发育中NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并可能促进突触的可塑性。神经再生包括干细胞的增殖、移行、分化和突触形成等环节，在细胞移行和突触形成过程中需要特定的信号引导。现已证明，NCAM是神经干细胞发育迁移期的特殊标志物，在神经干细胞的迁移过程中扮演着重要角色，直接反映神经干细胞的迁移能力，并能诱导细胞出芽及与目标细胞的连接[8-10]，如江山等[1]研究发现，行为学训练能显著增强NCAM在脑梗死大鼠海马齿状回区的表达，而且还可增强神经干细胞的迁移能力，促进神经功能恢复。因此，调节NCAM的表达可影响神经再生，促进脑组织修复。
补阳还五汤是中医学治疗缺血性中风的传统有效名方，既往研究表明，补阳还五汤能促进脑缺血后神经干细胞的增殖[9]、增强内源性神经再生能力[3]，但其作用尚不明确。本实验证实NCAM在正常脑组织有少量表达，脑缺血后NCAM表达明显增强，与有关文献报道一致[10,12]，补阳还五汤能显著增强脑内NCAM表达，延长其高表达的时限，提示脑缺血后NCAM表达上调是机体对抗损伤的内源性途径，也可能是补阳还五汤促神经再生的机制之一。
[参考文献]
[1]Fercakova A. Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity [J]. Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
[2]冯玲,孙新芳.补阳还五汤对脑卒中康复的影响[J].中国康复理论与实践,2005,11(6):465-466.
[3]刘柏炎,蔡光先,陈雪梅,等.补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经元再生的影响[J].中华神经医学杂志,2007,6(8):762-765.
[4]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke,1989,20(1):84-91.
[5]Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al, Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination [J] ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2366KB，3页)。