吸入低浓度CO抑制兔心肌缺血-再灌注后核转录因子CHOP的表达(2)
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1.2 心肌缺血-再灌注家兔模型的建立及分组
1.2.1 分组40只家兔，按随机化原则分为4组，每组10只。①假手术组(sham组)：只穿线，不结扎冠状动脉，其余手术过程同其他组。②缺血-再灌注组(I-R组)：结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注2 h。③CO前处理组：心肌缺血前24 h将兔饲养于密闭容器内持续吸入250 ppm CO，24 h；容器内设有食物和饮水，内置CO检测仪和氧气浓度监测仪，以保证CO和氧气浓度的稳定。④低氧前处理组：心肌缺血前在密闭容器内维持低氧0.5 atm，24 h。
1.2.2 模型制作术前禁食12 h，自由饮水，由耳缘静脉以25%乌拉坦(750 mg/kg)注射麻醉后固定于兔台，气管插管连接动物呼吸机进行机械通气，频率38次/min，潮气量10～15 ml/kg。手术分离出左颈总动脉，用自制导管插入左心室，并经压力感受器与BILOAP98多项导联生理记录仪连接。胸骨左侧切口，沿左3～4肋间开胸暴露心脏，剪开心包，制作心包吊床，于左冠状动脉前降支主干根部下(LAD)1/2处穿PROLENE 5-0线备用。将穿过冠脉前降支的结扎线结扎(打活结)，然后关闭胸腔；结扎30 min后，重新打开兔胸腔，松开结扎线，再灌注2 h。以心电图ST弓背向上抬高、局部心肌颜色变苍白为结扎有效指标。再灌注2 h后处死家兔，取出心脏，根据需要对心脏进行不同的处理。
1.3 CHOP的Western blot分析
留取包括心尖、室间隔和左心室的大部分心脏，剔除右心室游离壁，提取心肌组织总蛋白，Bradford法蛋白定量后分装、-70℃保存。取上述蛋白提取液的上清(含蛋白100 μg)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，10%分离胶)，将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭、洗脱后加入羊抗兔CHOP单克隆抗体(1∶200)，室温孵育4 h，洗膜后以相应的二抗室温孵育1 h，并以羊抗兔β-actin(1∶200)单克隆抗体同上操作，作为上样对照。抗原-抗体复合物用ECL法显示，暗室X线胶片曝光，采用Image-Pro Plus图像分析软件分析蛋白条带的积分光密度值(IOD)，IOD=平均光密度值×面积，以靶蛋白IOD/β-actin IOD的比值反映靶蛋白的相对水平。
1.4 统计学处理
数据以均值±标准差(x±s)表示，所有数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，独立两样本比较采用t检验；多个均数间采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
缺血前持续吸入CO对CHOP表达的影响：采用CHOP特异性抗体进行免疫印迹检测，结果(图1)显示：sham组有CHOP基础表达，I-R诱导CHOP表达明显增多，其相对蛋白含量为sham组的1.61倍(P<0.05)；缺血前持续吸入CO则明显抑制I-R所致的CHOP表达升高，较I-R组低25.16%(P<0.05)，与缺血前持续低氧组比较，有显著性差异(P<0.05)。缺血前持续低氧组与I-R组相比，无显著性差异(P>0.05)。
图1CHOP的Western blot及IOD比值
(sham为假手术组，I-R为缺血-再灌注组，CO为CO前处理组，hypoxia为低氧前处理组)
3 讨论
外源性CO与对缺血-再灌注损伤的保护作用的具体机制一直没有彻底阐明，其抗缺血-再灌注损伤的作用机制被认为与很多途径有关[3-10]。内质网是真核细胞内蛋白质合成、翻译后修饰、折叠的重要细胞器和钙离子储存库，其结构和功能的重要性决定了其对多种刺激非常敏感。细胞内钙失稳态、氧化应激、内质网腔内错误折叠蛋白的聚集等均可引起内质网功能障碍，即触发ERS。近年来内质网凋亡信号途径在I-R损伤诱发细胞凋亡机制中的作用引起广泛重视，过度ERS通过破坏Ca2+稳态、诱导细胞凋亡而加重I-R损伤[11-12]。CHOP表达是触发ERS相关凋亡途径的重要信号转导通路。CHOP存在于细胞质内，在ERS时被活化转位至细胞核，通过下调Bcl-2的表达而促进细胞凋亡[13]。Kim等[2]在HUVECs细胞中证实外源性的CO通过使PERK磷酸化来激活Nrf2，来刺激HO-1的表达；同时通过抑制CHOP的表达阻止ERS的损伤作用，是通过p38MAPK途径作用的。Kim等[2]认为，HO-1/CO系统上调了ERS诱导的生存途径，即PERK介导的生存信号途径；抑制了ERS诱导的凋亡途径，即抑制了转录因子CHOP的转录，从这两方面发挥其对抗ERS激活的未折叠蛋白反应(UPR)损伤过重所致的损伤。从本实验对CHOP表达的蛋白测定可知，在活体心肌缺血-再灌注损伤中，通过吸入低浓度CO可以明显抑制缺血-再灌注损伤所致的过度ERS而引起的CHOP表达增加，阻断凋亡信号传导通路，减轻ERS相关细胞凋亡的发生，阻断凋亡信号传导通路而发挥心肌保护作用。与Kim等[2]的发现相符。
至此笔者得出结论：外源性CO对心肌I-R所致器官损伤的防治作用可能是通过调控细胞凋亡实现的。缺血前持续吸入低浓度CO则能明显抑制I-R所致ERS过度应激的CHOP表达升高，来发挥其在心肌缺血-再灌注损伤中的抗凋亡作用，该作用与吸入CO引起的低氧无关。
虽然不能仅仅通过对家兔的心肌缺血-再灌注损伤试验来推测对人类心肌缺血-再灌注损伤的起防治作用的CO的最有效浓度，但通过对兔的研究可以推测在安全范围内吸入相对高浓度的CO可能明显改善人类的心肌缺血-再灌注损伤。但是临床中如何应用吸入CO来防治心肌缺血-再灌注损伤仍然需要大量的研究。在未来通过对其他种属的大量试验研究能为临床提供重要的理论支持。总之，通过这些数据我们相信吸入CO将来能作为一种防治心肌缺血-再灌注损伤的重要治疗方法 ......
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