睾丸肿瘤抗原MAGEA1及MAGEA3在小鼠头颈部鳞癌及癌旁组织中的表达(2)
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1 材料与方法
1.1 实验动物
6周龄雄性Balb/c近交系小鼠80只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重(23.81±1.21) g，常规每5只饲养于一笼内，实验过程中，动物自由饮水、进食。
1.2 主要试剂
4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)购自美国Sigma公司；一抗：兔抗鼠MAGEA1多克隆抗体为Scientific NeoMarkers产品，购自晶美生物公司，工作浓度为IHC 1∶50。兔抗鼠MAGEA3多克隆抗体为Protein Tech Group产品，购自北京西美杰科技有限公司，工作浓度为IHC 1∶100。二抗PV-6001山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，免疫组化染色鼠PV试剂盒(PV-6001)、浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 给药方式实验组：4NQO用蒸馏水配制成0.05%浓度，置于4℃冰箱中避光保存。用时以普通自来水配成0.005%浓度置于避光瓶内自由饮用。对照组：普通自来水置于透明塑料瓶中自由饮用。每周更换实验组和对照组饮水2次。
1.3.2 实验分组按随机数字表将80只小鼠随机分为7组：A、B、C、D、E、F、G组，A～F 6组为实验组，其中A～E组每组10只小鼠，F组20只小鼠，至16、20、24、28、32、36周时处死。G组为对照组10只小鼠，于实验开始时处死5只，实验结束时处死5只。
1.3.3 取材处死小鼠后立即取材，取全舌和食管组织标本，观察、标记、测量标本的大体损害，以4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片，做HE染色和免疫组织化学染色。由2名经验丰富的病理科专业医师对结果进行评估。HE染色诊断与分级参照WHO(1978)标准。
1.3.4 免疫组织化学染色根据PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒进行，用小鼠睾丸组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判定
采用Olympus CX-3显微镜观察，MAGEA1及MAGEA3蛋白表达主要位于细胞质中，阳性表达细胞质呈棕黄色或黄褐色颗粒。每张切片随机观察5个高倍镜视野。参照标准，高倍镜下综合染色强度和阳性细胞数所占比例进行半定量处理。染色强度评分标准：不着色0分；黄色1分；棕黄色2分；黄褐色3分。阳性细胞所占比例评定标准：阳性细胞数<10%者0分；10%～40%者1分；40%～70%者2分；≥70%者3分。两种评分相加，0～1分为(-)；2分为(+)；3～4分为(++)；5～6分为(+++)。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行处理，上皮异常增生过程中MAGEA1、MAGEA3 蛋白的表达采用Spearman秩相关，MAGEA1、MAGEA3蛋白在头颈部鳞癌不同区域的表达采用R×C的χ2检验分析，检验水准α=0.05。差别有统计学意义者进行两两比较(Bonferonni法)，调整检验水准α=0.017。
2 结果
2.1 一般情况
实验结束时可评价的小鼠73只，实验完成前死亡7只(经尸检，尿潴留膀胱憋胀死亡3只，肺炎死亡2只，因组织分解不能进行尸检2只)。另有实验组2例小鼠解剖时发现一侧肾脏高度积水，呈水囊状。
2.2 MAGEA1、MAGEA3蛋白在上皮异常增生的不同时期的表达
HE染色指导下选择出正常黏膜25 张切片、轻中度异常增生黏膜25 张切片、重度异常增生29 张切片、浸润癌41张切片，共120 张切片进行免疫组织化学染色，镜下，MAGEA1、MAGEA3蛋白主要表达于细胞质，细胞质呈棕黄色或黄褐色颗粒，结果见表1。
表1 上皮异常增生过程中MAGEA1、MAGEA3 蛋白的表达(例)
MAGEA1和MAGEA3蛋白在正常黏膜中几乎不表达。上皮异常增生的不同时期与MAGEA1的表达程度密切相关，且呈正相关(rs=0.55，P<0.001)，也与MAGEA3的表达程度密切相关，也呈正相关(rs=0.49，P<0.001)，即随舌黏膜异常增生程度增加，MAGEA1、MAGEA3蛋白表达增强。
2.3 MAGEA1及MAGEA3蛋白在癌及癌旁组织中的表达
经HE染色诊断为浸润鳞癌41例，IHC结果显示，MAGEA1及MAGEA3蛋白主要表达于细胞质及鳞癌巢周围，可以观察到有大量的淋巴细胞浸润，并可以看到上述蛋白在癌巢中的表达存在异质性。MAGEA1、MAGEA3蛋白在鳞癌原发灶及癌旁<5 mm区、>5 mm区的组织中表达结果见表2。
表2 MAGEA1、MAGEA3蛋白在头颈部鳞癌不同区域的表达[n(%)]
鳞癌原发灶及癌旁<5 mm区、>5 mm区的MAGEA1组、MAGEA3组、MAGEA1和MAGEA3组MAGEA1或MAGEA3组差异均有统计学意义。用Bonferroni法对其进行两两比较，调整检验水准α=0.017，MAGEA1或MAGEA3在癌中心区及<5 mm区无显著性差异，MAGEA1和MAGEA3在<5 mm区和>5 mm区无显著性差异，其余各组间差异均有统计学意义。即从癌中心区→癌旁<5 mm区→>5 mm区上述抗原表达均呈逐渐减弱趋势，>5 mm区基本正常。
3讨论
肿瘤特异性抗原MAGE，由HLA分子递呈。CTL通过识别MAGE基因的表达产物，可以特异性地识别并杀伤肿瘤细胞[3-5]。因此，MAGE基因在肿瘤特异性免疫治疗的研究中备受关注。
本研究发现，MAGEA1、MAGEA3基因在头颈部鳞癌组织中有较高的表达率，分别为61%和56%，而且同一癌组织同时表达两种基因的也较多，为46%，至少表达其中一种的为71%。Eura等[6]用RT-PCR方法研究了83例头颈部鳞状细胞癌的新鲜标本，发现MAGE-1、-2、-3、-4、-5和-6在mRNA水平的表达率分别为33%、41%、43%、27%、19%、42%，其中71%的标本至少表达这些MAGE基因中的一种 ......
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