CoQ10对DA损伤PC12细胞保护作用的实验研究(2)
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1.5 主要观察指标
CoQ10对DA所致PC12细胞损伤的影响。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析进行组间比较，数据处理均应用SPSS 10.0软件包完成，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞生长活力检测
PC12细胞培养液中加入DA 12 h后，其成活细胞数明显少于Ⅴ组(P<0.01)，而同时加入CoQ10，成活细胞数明显增加，并且与剂量呈正相关，当剂量增加到450 μmol/L时，细胞数与空白对照组比较，已无显著性差异(P>0.05)。结果见表2，生长曲线见图1。
表2 不同浓度的CoQ10与DA对PC12细胞活力的影响(×105个/ml)
与Ⅳ组比较，#P<0.05， ##P<0.01
2.2 CoQ10对培养液MDA含量的影响
在PC12细胞培养液中加入0.30 mmol/L的DA和不同浓度(50、150、450 μmol/L)的CoQ10，24 h后测定培养液中的MDA含量。结果表明，随着CoQ10浓度的增加，MDA值逐渐减小，呈负相关，说明CoQ10可减轻脂质过氧化反应，见表3。
表3 PC12细胞经DA和CoQ10处理后24 h培养液MDA含量
与Ⅳ组比较，*P<0.01
3 讨论
3.1自由基损伤对DA神经元死亡的影响
PD是中老年人常见的神经退行性疾病，其病理基础是选择性中脑黑质多巴胺神经元丧失，导致纹状体DA含量显著减少。氧化应激、线粒体功能障碍及细胞凋亡都是引起PD的可能原因[3-4]。在PD患者黑质DA神经元线粒体中，CoQ10含量显著低于正常人[2]。Yoo等[5]研究发现，氧化应激参与了PD线粒体复合物Ⅰ的损伤过程。自由基生成增多，导致黑质DA神经元的过氧化损伤，自由基生成增多在DA神经元损伤机制中占有越来越重要的地位。MDA是脂质过氧化过程中的一种稳定产物，其值的高低直接反映被检物质脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。本研究检测了PC12细胞培养液中MDA含量，各实验组和对照组比较，有显著性差异(P<0.01)，至少从模型水平证明PD确实存在脂质过氧化过度。自由基包括超氧化物自由基、过氧化物自由基、羟自由基(·OH)，其中·OH毒性最大。在生理状态下产生的自由基一般由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)清除。中脑脑组织的抗氧化能力相对低于其他脑区，Agid等[6]研究指出，GSH-PX在中脑的分布是不均的，PD中受损最严重的黑质致密部分布最少。在此基础上，多种因素促使PD患者自由基生成增多。首先PD患者黑质中线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ活性明显降低，且主要位于黑质致密部[7]。线粒体是细胞的产能中心，也是自由基产生的重要场所，呼吸链的任何环节缺陷都引起自由基生成增多。其次，为了代偿DA神经元减少所引起的DA递质不足，残存的DA神经元生成DA增加，使DA更新率增高。而多巴胺在代谢过程中产生氧自由基、·OH等自由基及过氧化氢、6-OHDA等这样的具有自由基毒性的代谢产物。PD患者黑质中铁含量较对照组增高50%，而且主要分布在黑质致密部。铁离子能催化过氧化氢形成 ·OH。另外，钙超载的细胞毒作用、神经系统老化、神经毒素等都是自由基增加的促发因素。
3.2 CoQ10的抗氧化及其对PD的抗凋亡作用
CoQ10在细胞内主要分布于线粒体内，是哺乳动物线粒体内膜呼吸链中重要的氧化还原成分，是线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的电子接受体。在细胞耦联磷酸化和线粒体呼吸链电子传递中起传递电子的作用[8-9]。
外源性CoQ10的补充纠正了病变组织的CoQ10缺乏状态，其抗氧化机制主要有：第一，自由基清除作用。外源性CoQ10能非特异性地与细胞某些部位相结合，增强了琥珀酸-细胞色素C还原酶活性，提供电子给超氧阴离子，使其被还原为氧原子，清除氧自由基。也有可能是CoQ10增强了SOD、GSH-PX等自由基防御系统的功能。此外，还有报道在膜水平上CoQ10具有直接抗自由基脂质过氧化的作用[10]。第二，促进线粒体生成ATP。细胞内CoQ10水平对维持线粒体呼吸链功能是一种限定因素，当CoQ10缺乏时可影响线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少，线粒体功能低下。及时补充外源性CoQ10有利于呼吸链电子转化功能的恢复，增强线粒体生成ATP的能力。第三，稳定细胞的膜结构，维持钙通道的完整性。CoQ10可能通过抑制线粒体膜上的磷脂酶A2减轻自由基对膜的损害，CoQ10还能增加ATP生成，为生物膜维持正常结构提供能量，间接稳定钙通道。
本实验比较了各组PC12细胞培养液中MDA含量，CoQ10组显著低于对照组，可以认为CoQ10具有减轻PC12细胞脂质过氧化反应的作用，这与国外一些研究CoQ10能减慢帕金森病发展的结果一致[11-12]。其机制可能是：外源性CoQ10通过保护线粒体膜和嵴，保持线粒体结构完整而维持其氧化磷酸化功能，减少自由基生成，同时，作为一种抗氧化剂，它有效清除了脂质过氧化产生的自由基，抑制磷脂酶A2对细胞膜磷脂的分解，对生物膜起保护和稳定作用。
本实验结果表明，CoQ10能显著降低DA引起的PC12细胞损害，这一结果提示，CoQ10作为神经保护性药物对保护DA能神经元、防治PD可能有实际应用价值。
[参考文献]
[1]Jankovic J. Levodopa strengths and weaknesses [J]. Neurology,2002,58(4 Suppl 1):19-32 ......
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