中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠体内药动学分析(2)
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1.3 试验动物
健康SD大鼠,雄性,体重(200±20) g,由湖南环境生物学院医学部实验动物中心提供,动物自由摄食自来水和普通饲料。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 色谱条件色谱柱为Shim-pack VP-ODS(4.6 mm×150 mm,5.0 μm),流动相为乙腈-3%醋酸(30∶70),检测波长为270 nm,流速为1.0 ml/min,内标为苯甲酸,柱温为室温,进样量为20 μl。
2.1.2 血浆样品的处理方法大鼠灌胃前尾静脉取血1 ml置于预先肝素化的试管中,离心(3 000 r/min,10 min),取上层血浆作为空白血浆;取3份空白血浆样品0.5 ml于10 ml具塞离心管中,加入同浓度的淫羊藿苷对照品溶液100 μl漩涡混合均匀,分别比较乙酸乙酯萃取、甲醇和乙腈沉淀法的色谱图和回收率,最后确定使用乙酸乙酯萃取法处理。
具体步骤如下:取样品加入2.5 ml乙酸乙酯,振荡萃取3 min,离心(5 000 r/min,5 min),移取上清液,于37℃水浴氮气吹干,残渣加入100 μl甲醇漩涡振荡1 min溶解,高速离心(10 000 r/min,2 min),取上清液20 μl进样。
2.1.3 药动学研究取SD大鼠110只,随机分为22组,每组5只,其中,11组给予复方,另11组给予淫羊藿提取物。实验前禁食(不禁水)12 h,第2天按体重灌胃给予复方(4.30 g/kg)和淫羊藿提取物[1.64 g(生药)/kg],相当于淫羊藿苷4.36 mg/kg,灌胃后于0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00 h 尾静脉采血1 ml,置于预先肝素化的试管中,离心(3 000 r/min,10 min),取上层血浆0.5 ml放入-20℃冰箱保存备用,每个时间点取5只大鼠。按“2.1.2”项下的方法处理后测定。
2.2 分析方法验证
2.2.1 系统适用性试验理论塔板数按淫羊藿苷计算不小于3 000,该峰与其相邻色谱峰的分离度大于1.5,对称因子小于1.050。
2.2.2 方法专属性0.5 ml空白血浆不加样,0.5 ml空白血浆中加入淫羊藿苷和内标物苯甲酸标准品及0.5 ml给药后大鼠血浆,按照“2.1.2”项下方法处理血浆样品后,分别观察其色谱行为,结果表明血浆中内源性物质不干扰淫羊藿苷和内标物的测定,并且二者峰形良好。淫羊藿苷和内标物苯甲酸的保留时间分别为7.1、5.8 min,见图1。
2.2.3 标准工作曲线及最低检测限测定分别精密量取淫羊藿苷贮备液适量,用甲醇稀释制成10.200 0、5.100 0、1.020 0、0.510 0、0.255 0、0.128 0、0.063 8 μg/ml的淫羊藿苷系列对照品溶液,于4℃保存备用。
标准工作曲线的绘制:取500 μl空白血浆7份,分别加入不同浓度的淫羊藿苷系列对照品溶液100 μl及内标溶液50 μl,漩涡振荡混匀后,按“2.1.2”项下操作,分别记录色谱图。以淫羊藿苷与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y),淫羊藿苷浓度为横坐标(X,μg/ml)作图进行线性回归,得标准曲线和回归方程为Y=0.041 3X+0.000 6,r=0.999 7,表明淫羊藿苷在0.063 8～10.200 0 μg/ml范围内线性良好。以信噪比S/N≥3时的浓度为最低检测浓度,得方法定量限为0.063 8 μg/ml。
2.2.4 精密度试验分别取空白血浆500 μl,精密加入高、中、低3个浓度(浓度分别为10.20、5.10、 0.51 μg/ml)的淫羊藿苷标准品100 μl,同时加入50 μl内标溶液,按“2.1.2”项下处理,每一浓度进行6个样本分析,连续测定3 d,与标准工作曲线同时进行血浆样品的浓度计算,求得方法的日内与日间精密度RSD。日内RSD分别为2.33%、3.11%、2.42%;日间RSD分别为3.36%、1.98%、2.75%。
2.2.5 提取回收率分别取空白血浆500 μl,精密加入高、中、低3个浓度(浓度分别为10.20、5.10、 0.51 μg/ml)的淫羊藿苷标准品100 μl,每个浓度各6样本,按“2.1.2”项下操作,测得血浆样品浓度,以样品经提取后的色谱峰面积与未经提取直接进样获得的色谱峰面积之比,考察样品的提取回收率及其RSD。高、中、低3个浓度的回收率分别为93.88%、90.82%、87.42%;RSD分别为2.17%、1.49%、1.84%。
2.2.6 稳定性试验取空白血浆500 μl,精密加入高、中、低3个浓度(浓度分别为10.20、5.10、0.51 μg/ml)的淫羊藿苷标准品100 μl及内标溶液50 μl,每个浓度各6样本,按“2.1.2”项下操作,进样20 μl记录样品的峰面积,剩余样本置于室温保存(约28℃),于6、12、24 h后重新测定,将3个浓度各时间点测得的峰面积比进行对照,计算RSD(%)。测得10.20、5.10、0.51 μg/ml样品的RSD分别为2.43%、5.36%、7.73%。实验结果表明,血浆样品经处理于室温保存24 h后,血浆中淫羊藿苷浓度仍可被准确测定。
2.3 药动学研究结果
将测得的血药浓度数据采用3P97实验药动学计算机程序,对血药浓度-时间数据进行拟合,根据AIC最小的原则选取房室模型,两组间的药动学参数比较采用两样本总体均数t检验 ......
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