COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性及其与肺功能和吸烟的关系(2)
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肺泡巨噬细胞由外周血单核细胞迁移至肺分化而来。因此,本研究假设外周血单核细胞中HDAC活性低于健康对照,并观察外周血单核细胞中HDAC活性与COPD患者气流受限(肺功能)的关系,同时观察吸烟量与HDAC活性的关系,以观察HDAC活性是否受吸烟量的影响。
1 对象与方法
1.1 受试者基本情况
收集在武汉大学人民医院体检及就诊的稳定期COPD患者。正常对照为健康志愿者。经患者知情同意,抽取外周静脉血20 ml,加少量肝素抗凝,在4 h内进行外周血细胞分离。
1.2 稳定期COPD诊断及分级标准
参照GOLD(2006修订版)和中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制订的慢性阻塞性肺病诊治指南(2002)。所有患者均除外心、脑血管、肝、肾疾病、糖尿病、肿瘤、风湿、结缔组织疾病,以及肺结核、支气管扩张、支气管哮喘及肺纤维化患者。
1.3 肺功能测定
所有受试者均行肺功能测定,采用Vmax6200(American Sensormedics, Vmax 229 series,Yorba Linda,California)肺功能系统检测FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC,由同一熟练技师操作,以保证测试的一致性。每位被测试者肺功能测定前3 d内未使用支气管扩张剂,2周内未使用茶碱和激素。
测试方法:吸入200 μg葛兰素后10 min,平静正常呼吸,遂后充分吸气至肺总量位,迅速用最大力呼气,呼气时间≥6 s,或时间-容量曲线显示呼气相平台出现且超过2 s后,用最快速度用力吸气至肺总量位。每个被测试者分别至少测定3次(一般最多不超过8次),每个被测试者最佳值与次佳值2次差异小于5% FVC或0.5 L)。
1.4 人外周血单核细胞分离
人外周血单核细胞分离用密度梯度离心法[2]。将静脉血与Hank's buffered salt solution (HBSS)1×缓冲液1∶1混合后共40 ml,装于50 ml试管中。将混合血与人淋巴细胞分离液(Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml)以2∶1体积混合。配平后用TDL-40L高速水平离心机离心,2 000 r/min(1 100 g/min),30 min。吸取中间白色薄雾层于新管。加HBSS于每管,将吸取液与HBSS混匀,HBSS体积大于1倍吸取液体积。配平后1 100 r/min,离心8 min。弃上清,加入HBSS吹打,移入一新试管中离心1 000 r/min,8 min,弃上清。将剩余液体混匀,吸取少量于细胞计数板计数,并用台盼蓝染色鉴定细胞活性。如果细胞总数大于1×107个/ml,活性大于95%,视为合格标本;用1 ml枪头吸取剩余液体于标记Ep管中,-70℃冻存。 1.5 直接组蛋白提取
组蛋白提取用HCl和H2SO4 4℃过夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亚硫酸氢钠,1% Triton X-100, 10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖,完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏分子生化公司),20 min,4℃];核冲洗缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4)。
将细胞微离心5 min;用冰冻裂解缓冲液反复冲洗片状沉淀物,直至浮于表面的物质清除(每次离心7 500 g/min,5 min)。用核冲洗缓冲液冲洗核片状沉淀物,并且用50 μl 0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸馏水中悬浮。4℃过夜提取细胞核,微离心剩余物质10 min,用1 ml冰冻丙酮混合上清液,-20℃过夜。微离心样本10 min,用丙酮冲洗,干燥,并用蒸馏水稀释。含有组蛋白的上清液样品用Bradford protein kit(Bio-Rad)定量。Bradford法(考马斯亮蓝)测组蛋白浓度。
1.6 HDAC活性检测
细胞核提取物HDAC活性检测使用HDAC活性荧光分析试剂盒(Cayman,USA),严格按照试剂盒说明操作。
1.7 统计学处理
结果用SPSS 11.0统计学软件进行分析。数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析;相关性采用Spearman相关性分析;P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 一般资料
COPD患者26例,均为吸烟者,其中,1期7例,2期8例,3期8例,4期3例;健康吸烟者10例;健康非吸烟者13例,所有受试者均为男性,其身高、体重等无显著性差异(P>0.05)。COPD组与健康吸烟组吸烟量无显著性差异(P>0.05)。COPD组平均年龄高于健康吸烟组和健康非吸烟组(P<0.05),健康吸烟组和健康非吸烟组年龄无显著性差异(P>0.05)。
2.2 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性
COPD患者外周血单核细胞总HDAC活性较健康非吸烟者低40%左右[(12.86±6.14) μmol/(L·μg)和(21.39±4.92) μmol/(L·μg),P=0.000];在1、2、3期达到显著性差异(图1);其活性与健康吸烟者比较,无显著性差异[(12.86±6.14) μmol/(L·μg)和(12.50±4.27) μmol/(L·μg),P=0 ......
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