高效液相色谱法测定维生素C阴道缓释片有关物质及含量(2)
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图 1 有关物质检查中系统适用性试验色谱图
Fig.1 The chromatogram of system suitability test for related substances
2.1.3 空白辅料的干扰性试验取上述空白辅料溶液,照上述色谱条件操作进样,结果表明,空白辅料对检测无干扰。色谱图见图2。
图 2 空白辅料干扰图谱
Fig.2 The chromatogram of interfering test for blank adjuvant
2.1.4 检测器检测限试验在上述液相色谱条件下,当信噪比为3∶1时,最低检测限为10.0 ng。
2.1.5 破坏性试验精密称取本品细粉适量(约相当于维生素C 25 mg),置25 ml容量瓶中,然后分别进行如下破坏性试验:
2.1.5.1 酸破坏加流动相适量振摇溶解,加1 mol/L盐酸溶液2 ml,摇匀,放置过夜,加流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为酸破坏供试液。
2.1.5.2 碱破坏加流动相适量振摇溶解,加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml,摇匀,放置过夜,加流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为碱破坏供试液。
2.1.5.3 氧破坏加流动相适量振摇溶解,加入5%的双氧水溶液2 ml,摇匀,放置过夜,加流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为氧化破坏供试液。
2.1.5.4 热破坏加流动相适量振摇溶解,于沸水浴中加热1 h,放置过夜,加流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为高温破坏供试液。
2.1.5.5 光破坏加流动相适量振摇溶解,并稀释至刻度,摇匀,5 000 Lx光照下放置过夜,过滤,取续滤液作为光破坏供试液。
分别取上述酸、碱、氧化、高温和光破坏试验的供试液10 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,见图3。结果表明在上述色谱条件下,维生素C阴道片经酸、碱、氧化、高温、光照破坏后,所产生的杂质峰均能与主峰达到基线分离,说明该系统能有效检测降解产物。
2.1.6 样品有关物质检测在上述液相色谱条件下,取对照溶液10 μl注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱的峰高为仪器满量程的10%～15%。精密量取供试品溶液和对照溶液各10 μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰,各杂质峰的面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%)。结果批号为20080420、20080421、20080422的3批样品的有关物质分别为0.12%、0.13%、0.13%,平均值为0.13%。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验同有关物质项下。
2.2.2 溶液制备
2.2.2.1 空白辅料溶液的制备按处方比例制备不含维生素C的空白辅料,从中精密称取辅料细粉适量(按处方量约相当于维生素C 100 mg),置100 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量振摇溶解并稀释至刻度,摇匀,经干燥滤纸滤过,再精密量取续滤液5 ml,置50 ml容量瓶中,加新沸冷却的水稀释至刻度,摇匀,备用。
2.2.2.2 供试品溶液的制备取本品20片,研细,精密称取细粉适量(约相当于维生素C 100 mg),置100 ml容量瓶中,加新沸冷却的水(加新沸冷却的水目的是减少水中溶解的氧对测定的影响)适量,振摇溶解并稀释至刻度,摇匀,经干燥滤纸滤过,再精密量取续滤液5 ml,置50 ml容量瓶中,加新沸冷却的水稀释至刻度,摇匀,备用。
2.2.2.3 对照品溶液的制备取维生素C对照品约100 mg,精密称定,置100 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量,振摇溶解并稀释至刻度,摇匀,再精密量取上述溶液5 ml,置50 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量并稀释至刻度,摇匀,备用。
2.2.3 测定方法分别精密量取上述空白辅料溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。在上述液相色谱条件下,空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液的高效液相色谱图见图4,由图可知,空白辅料对维生素C含量测定无干扰。维生素C含量按外标法以峰面积计算。
图 4 含量测定HPLC色谱图
(A.空白辅料; B.对照品; C.供试品)
Fig.4 HPLC chromatogram of the content determination
(A.Blank supplements; B.Reference substance; C.Sample)
2.2.4 线性关系考察精密称取维生素C对照品适量(实际称重0.023 5 g),置100 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量,振摇溶解并稀释至刻度,摇匀;然后从中精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml,分别置于10 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量并稀释至刻度,摇匀。分别取上述溶液进样10 ml,记录色谱图,以浓度C(μg/ml)为横坐标,主峰面积A为纵坐标作标准曲线,得线性方程为A=32.077C-77.777,r=1.000 0(n=5)。结果表明,维生素C在23.5～188.0 μg/ml浓度范围内与峰面积成良好的线性关系。
2.2.5 稳定性试验精密称取维生素C对照品适量,用新沸冷过的水适量振摇溶解并稀释制成约100 μg/ml的溶液,分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h进样10 ml,考察溶液的稳定性,计算主峰面积的RSD。结果待测溶液在室温下放置3 h,用归一法计算其主峰面积A的平均值为2 857.753,RSD为0.98%。这表明待测溶液在室温下放置3 h内基本稳定。但考虑到维生素C的不稳定性,所以配制好的供试品溶液最好在2 h内测定完毕。
2.2.6 回收率试验精密称取维生素C对照品适量(低80 mg、中100 mg、高120 mg,各3份),共9份,按维生素C阴道片处方量加入空白辅料,分别置100 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量,振摇溶解并稀释至刻度,摇匀,经干燥滤纸滤过,再分别精密量取续滤液5 ml,置50 ml容量瓶中,加新沸冷却的水适量并稀释至刻度,摇匀,备用 ......
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