益气活血中药对大鼠缺血-再灌注脑组织中氨基酸含量的影响(2)
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1.4 大鼠脑缺血-再灌注模型的制作
参照Koizumi[1]方法制成大鼠大脑中动脉缺血-再灌注模型。取1号尼龙钓鱼线,截取为长约5 cm的小段,用酒精灯将其头端烫成球形,在所需长度处做标记,将此线浸泡消毒,然后将栓线头端浸入0.1%多聚赖氨酸溶液中过夜,60℃烤箱中1 h后取出,浸入1.25万U/ml肝素盐水中备用。将大鼠称重后,以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉,仰卧固定于手术台上,常规消毒,取颈前正中切口,钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨锁骨肌,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA),避免损伤迷走神经。分离颈内动脉至颅底,结扎颈内动脉颅外段的唯一分支翼腭动脉(PPA),再结扎颈总动脉近心端,于颈总动脉分叉处结扎颈外动脉,以微动脉夹夹闭颈内动脉。在右侧颈总动脉接近分叉处剪一小口插入鱼线并用手术线轻度结扎,松开微动脉夹,轻推鱼线,沿颈总动脉入颈内动脉至有阻力时止,系紧结扎线,鱼线尾端露于体外。从颈总动脉分叉处算起进线17～18 mm,此时鱼线头端入大脑前动脉,其体部阻挡住大脑中动脉入口,形成大脑中动脉供血中断。大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)后2 h拔出栓线约10 mm,此时形成再灌注,供血从大脑前、后动脉流入大脑中动脉。术中及清醒前均给予头灯(100 W)照射,保持肛温36.5～37.5℃,室温25℃。假手术除不插入尼龙线外,其余手术步骤均与缺血-再灌注各组相同。
1.5 模型纳入标准
术后2 h观察大鼠的症状和体征,参照Longa等[2]评定神经功能缺损程度的5级4分法标准:0分,无神经功能缺损症状;1分,轻微神经功能缺损,不能完全伸展左侧前爪;2分,中度局灶性神经功能缺损,向左侧转圈;3分,重度局灶性神经功能缺损,向左侧倾倒;4分,不能自发行走,意识水平下降。其中,0分及4分者被剔除。评分1～3分为造模成功,纳入实验。假手术组可出现同侧Horner征,但无左侧肢体瘫痪。
1.6 动物分组及给药方法
选雄性SD大鼠30只,用随机数字表法随机分成3组,每组10只:假手术组,模型组,芎芪合剂治疗组。
栓塞后1.5 h各组给药方法如下:①假手术组、模型组腹腔注射生理盐水2 ml/200 g;②芎芪合剂治疗组腹腔注射中药稀释液2 ml/200 g,为临床用量的10倍(以临床用量200 mg/70 kg计)。栓塞后2 h拔出线栓形成再灌注。芎芪合剂治疗组再灌注12 h后腹腔注射芎芪合剂稀释液2 ml/200 g,假手术组、模型组再灌注12 h后腹腔注射生理盐水2 ml/200 g。
1.7 氨基酸检测
1.7.1 色谱条件Hypersil ODS色谱柱,4.0 mm×125 mm,粒径5 μm;流动相(A):10 mmol/L Na2HPO4 pH 7.2缓冲液(PB);流动相(B):PB-甲醇-乙腈(50∶35∶15)。线性梯度:在0～25 min内,流动相B以线性从0上升到100%。流量:1.0 ml/min。柱温40℃。检测波长:激发波长340 nm,发射波长450 nm。
1.7.2 标准溶液准确称量氨基酸对照品后,用0.1 mol/L HCl溶液溶解并稀释配成含每种氨基酸20、50、100、150、200、250、300 nmol/ml的系列混合标准溶液。
1.7.3 样品处理在缺血2 h再灌注24 h评分后,各组大鼠断头取脑,完整剥取脑组织,用冷生理盐水将表面的血液冲洗干净,去除嗅球、小脑和低位脑干,取右侧(缺血侧)脑组织,精确称取100 mg置匀浆器中,加适量90%乙醇溶液匀浆3 min,倒入离心管,1 000 r/min离心10 min,取上清液,将残留物重复匀浆2次,合并上清液。将上清液在80℃水浴中蒸干,用0.1 mol/L HCl定容至5 ml。1 000 r/min离心10 min,上清液经0.45 μm滤膜过滤,待测。采用HP1050型高效液相色谱仪检测氨基酸:谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、γ-氨基丁酸(GABA),结果以mg/g湿脑组织表示。
1.8 统计学处理
数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),然后用post hoc检验中的LSD法(方差齐时)或Dunnett's T3(方差不齐时)做多个均数间的两两比较。检验水准α=0.05,双侧检验。
2 结果
2.1 芎芪合剂对脑缺血-再灌注后大鼠脑组织中兴奋性氨基酸(Glu、Asp)含量的影响
见表1。
表1芎芪合剂对模型大鼠缺血2 h再灌注24 h后
Glu、Asp含量的影响(x±s)
与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,▽P<0.05
表1结果提示:①模型组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05),提示脑缺血2 h再灌注24 h后,模型组大鼠缺血侧脑组织中Glu、Asp含量增高;②芎芪合剂治疗组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),提示芎芪合剂治疗组大鼠缺血侧脑组织中Glu、Asp含量较模型组降低;同时,芎芪合剂治疗组与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05),提示芎芪合剂能降低大鼠缺血侧脑组织中Glu、Asp含量,并使之趋向于正常。
2.2 芎芪合剂对脑缺血-再灌注后大鼠脑组织中抑制性氨基酸(Gln、GABA)含量的影响
见表2。
表2芎芪合剂对模型大鼠缺血2 h再灌注24 h后
Gln、GABA含量的影响(x±s)
与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,▽P<0.05
表2结果提示:①模型组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05),提示脑缺血2 h再灌注24 h后,模型组大鼠缺血侧脑组织中Gln、GABA的含量增高;②芎芪合剂治疗组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0 ......
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