多重PCR法检测金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因(2)
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参见附件。
1.6 多重PCR扩增体系及反应条件
把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20 μl反应体系,模板1 μl,起始引物和终末引物各1 μl,dNTP 1.5 μl,Taq酶0.2 μl,10× Buffer 2 μl,Mg2+ 2 μl,双蒸水11.3 μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。
1.7 序列测定
将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析
84株金葡菌中检出mecA基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。
图1 PVL阳性菌株电泳结果
(1～6、9～11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)
2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点
PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液 ......
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