骨髓间充质干细胞对大鼠实验性肺气肿的作用(2)
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1.2.2 大鼠肺气肿模型的制作参照许三林等的方法自制大鼠实验性被动吸烟装置,将大鼠置于自制玻璃箱内被动吸烟,每次点燃香烟(金丝猴牌,宝鸡卷烟厂制)10支,1次/d,持续30 min,每周6次,连续12周,12周后肺气肿形成。
1.2.3 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养取6周龄Wistar雌鼠1只,采用无菌操作的方法,用咬骨钳将股骨和胫骨两骨端剪去,用PBS缓冲液将骨髓冲入离心管中,用吸管吹吸混匀。用比重为1.077 g/ml的淋巴细胞分离液进行分离,用含10%胎牛血清的DMEM培养液悬浮细胞,置于37℃、5% CO2培养箱中孵育。待细胞生长密度达80%～90%时进行消化,以1∶2比例进行传代,扩增培养[7],通过多次传代对细胞进行纯化,取第3代细胞。
1.2.4 细胞标记取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,加入无菌的DAPI至终浓度为50 g/L,在37℃条件下孵育30 min,离心后PBS反复洗涤以去除未结合的DAPI,离心收集细胞,稀释至1×1010/L,放于冰浴中,1 h内将细胞通过尾静脉注射注入受体大鼠体内。
1.2.5 肺组织病理标本的制备断颈处死大鼠后,在胸部切断肋骨,以暴露气管、肺脏等,主支气管切断后用弯钳将其提起,沿背部脊柱前方分离,将肺脏及心脏分离出来,剪去心脏后在25 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)压力下经气管灌注10%中性甲醛溶液固定肺脏30 min,结扎气管,浸入10%中性甲醛溶液,固定48 h,每只大鼠各取双侧最大横径处肺组织,常规石蜡包埋切片,HE染色。
1.2.6 Pan-cytokeratin免疫荧光染色石蜡切片脱蜡后,将切片放入蒸馏水中,PBS洗3次,5 min/次,0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)微波抗原修复,滴加5% BSA封闭液,加入Anti-Pan-cytokeratin(稀释比1∶200,抗体稀释液为0.3% Triton X-100/PBS),4℃过夜,阴性对照组用PBS代替。加入羊抗兔IgG-Cy3(稀释比1∶50)1∶100稀释,50%缓冲甘油封片,荧光显微镜观察荧光染色的结果并拍照 ......
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