水通道蛋白4\7\8基因mRNA在新生鼠小肠结肠炎模型中的表达(2)
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1.3.2动物模型的制作[3]
先给低氧舱通入99.99% CO2,调节流速,应用CY-7指针式测氧仪,测得舱内的CO2浓度达99%后,放入1日龄新生SD大鼠5 min后取出,迅速向舱内通入99% O2,应用测氧仪使舱内氧浓度达99%,再将低氧后新生鼠放入舱内5 min取出。经处理后所有新生鼠均放回母鼠身边喂养,至第4天断头处死,用眼科剪行剖腹术取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织,-70℃冻存。
1.3.3 染料法(SYBR GreenⅠ法)荧光定量PCR反应
1.3.3.1 鼠肠组织总RNA提取 总RNA提取试剂盒由Promega公司提供,按照操作说明上的SV Total RNA Isolation System步骤进行总RNA提取,并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,紫外分光光度计测定A260和A280确定RNA质量。28s rRNA条带强烈且A260/280位于1.8～2.0之间的RNA样品用于后续实验。
1.3.3.2 逆转录反应 逆转录反应使用Takara试剂盒进行,取总RNA 4.0 μl,依次加入5× Prime ScriptTM Buffer 2 μl,Prime ScriptTM RT Enzyme Mix 0.5 μl,Oligo dT Primer 0.5 μl,Random primers 0.5 μl,加无RNase水补足配成总体积10 μl的反应液,37℃ 15 min(逆转录反应),85℃ 5 s(逆转录酶的失活反应),合成好的cDNA放入-20℃冰箱保存备用。
1.3.3.3 引物的合成 荧光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成,PAGE纯化级别。引物序列如下:β-actin,F 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3',R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3',第1 026～1 175位核苷酸,片段长150 bp;AQP4,F 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3',R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3',第2 615～2 731位核苷酸,片段长117 bp;AQP7,F 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3',R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3',第322～468位核苷酸,片段长147 bp;AQP8,F 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3',R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3',第292～417位核苷酸,片段长126 bp ......
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