实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与NF-κB的表达(2)
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1.2.2.1 常规HE染色切片常规脱蜡、水化,依次经苏木素染色、1%盐酸酒精分化、返蓝以及伊红染色后进行脱水、透明、封片。光镜下观察,胞质为红色,胞核为蓝色。
1.2.2.2 TUNEL染色以TUNEL法检测凋亡细胞。切片常规脱蜡、水化,滴加脱氧核糖核酸转移酶(TDT)和地高辛标记的dUTP反应液,37℃孵育120 min;滴加生物素化抗地高辛抗体,37℃孵育30 min后DAB显色,苏木素复染,脱水、透明、封片。
1.2.2.3 NF-κB/p65免疫组化染色用免疫组化SABC法检测NF-κB/p65蛋白的表达。切片常规脱蜡、水化后行抗原热修复,滴加50 μl兔抗鼠多克隆NF-κB/p65抗体(1∶200),4℃过夜;然后滴加生物素化山羊抗兔IgG,室温20 min;滴加SABC,室温20 min。DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。
1.3统计学处理
在400倍光镜下观察并随机选择血肿周围5个不重复视野,计算阳性细胞积分光密度。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0软件进行数据分析,采用t检验及Pearson相关分析,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色
脑出血后6 h可见轻度脑水肿,血肿内红细胞形态完整。1 d可见脑水肿明显,血肿周围可见中性粒细胞及淋巴细胞浸润,胶质细胞开始增生。3 d时脑水肿最重,大量炎症细胞浸润,胶质细胞增生明显,大量神经元变性坏死。7 d时血肿有所吸收,血肿周围组织疏松,胶质细胞及血管增生明显。假手术组及对照组无明显病理改变。见图1。
图1 脑出血后不同时间点HE染色(×400)
(A.脑出血后6 h;B.脑出血后1 d;C.脑出血后3 d;D.脑出血后7 d)
2.2 TUNEL染色
TUNEL染色阳性细胞是凋亡细胞,表现为核周染色质浓缩的点状深染棕褐色细胞。凋亡细胞在脑出血后6 h出现,1 d明显增多,3 d达到高峰,此后逐渐减少,持续到7 d,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。凋亡细胞主要分布在脑出血周围组织和同侧大脑皮层 ......
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