京尼平交联的脱细胞牛心包生物支架材料的实验研究(2)
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1.2 新鲜牛心包的处理
从养牛场采集新鲜成年牛心包,冰盐水保存运输,3～6 h后剔除心包表面残留的脂肪及其他结缔组织,然后4℃ D-Hanks液漂洗,随机分成三组:A组(25块)为新鲜未脱牛心包组织,B组(25块)为脱细胞牛心包组织,C组(25块)为京尼平交联的脱细胞牛心包组织;然后对B组(25块)和C组(25块)采用去污剂-酶消化法处理获得脱细胞牛心包组织。 1.3 脱细胞支架材料的实验方法
①将B组(25块)和C组(25块)牛心包浸入4℃、pH 8.0且含0.05 mol/L NaCl、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。②浸入4℃、pH 8.0且含1.5 mol/L NaCl、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。③4℃,pH 7.4,D-Hanks液清洗。④用4℃、pH 7.4且含1% Triton X-100、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的Tris-HCl浸泡24 h。⑤4℃、pH 7.4、不含Mg2+、Ca2+的D-Hanks液清洗。⑥37℃、pH 7.6、含DNAaseⅠ(10 mg/L)、RNAaseA(1 mg/L)、Mg2+(3 mmol/L)、Ca2+(1 mmol/L)的10 mmol/L Tris-HCl消化1～2 h。⑦4℃、pH 7.4、含1% Triton X-100的Tris-HCl浸泡24 h。⑧4℃、pH 7.4 D-Hanks液浸泡48 h。
1.4 京尼平交联脱细胞牛心包组织
C组(25块)采用含碘溶液[2]于37℃孵箱内作用48 h予以消毒,然后在37℃用0.625%京尼平溶液交联脱细胞的新鲜牛心包组织72 h[3],磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗备用。
1.5 检测项目
1.5.1组织学观察将A组、B组牛心包组织各5条置入10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋、切片、HE染色后在显微镜下进行组织学观察和扫描电镜观察 ......
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