结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究(2)
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1.2 方法
1.2.1引物设计与合成参考GenBank中的结核分枝杆菌标准株H37Rv的ESAT6(216 bp)及CFP10(303 bp)基因序列设计引物,在CFP10上游引入EcoRⅠ酶切位点,下游引入5个甘氨酸柔性接头(序列为GGA GGT GGA GGT GGA);在ESAT6上游同样引入5个甘氨酸柔性接头,下游引入XhoⅠ酶切位点。CFP10上游引物:5'-GCG AAT TCA TGG CAG AGA TGA AG-3′,CFP10下游引物:5'-GGA GGT GGA GGT GGA GAA GCC CAT TTG CG-3′;ESAT6上游引物:5'-GGA GGT GGA GGT GGA ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT-3′,ESAT6下游引物:5'-CCG CTC GAG TGC AGC GCG TTG TTC AGC T-3′[4],引物由宝生物(大连)公司合成。
1.2.2 CFP10-ESAT6P基因的构建及克隆以结核分枝杆菌基因组的DNA为模板,分别以ESAT6和CFP10引物进行PCR扩增。产物经琼脂糖凝胶电泳割胶回收,各取1 μl,分别以CFP10上游引物和ESAT6下游引物进行重叠PCR扩增,反应条件同上,产物经琼脂糖凝胶电泳割胶回收,得到目的基因,与pMD18-T在16℃下连接转化感受态细胞DH5α后,涂板于含氨苄青霉素100 μg/ml的LB平板上,挑选单菌落抽提质粒进行酶切鉴定,将目的片段与pET30a载体在T4 DNA连接酶的作用下16℃连接过夜,转化于DH5α中,阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序,测序结果用Staden Package软件分析,并用Clustal Ⅹ与原始序列进行比对。序列正确的克隆转化到大肠埃希菌BL21中,证实重组表达质粒构建成功 ......
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