抑癌基因FHIT和PTEN在肝细胞癌中的表达及其意义(2)
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1 材料与方法
1.1 材料
随机抽取哈尔滨医科大学附属肿瘤医院2004～2006年经手术治疗的44例HCC患者的存档标本作为实验组,其中,男30例,女14例;年龄31～72岁,平均52岁;术前均未行放、化疗,其中39例患者经信件或电话随访。HBsAg阳性30例;抗-HBc阳性2例;血清AFP水平阳性27例;分化程度按Edmondson标准[1]:Ⅰ级10例,Ⅱ级14例,Ⅲ级16例,Ⅳ级4例;TNM临床分期按文献标准[2]:Ⅰ期8例,Ⅱ期28例,Ⅲ期8例。另取6例肝血管瘤术后组织及4例因胆道手术切除的部分正常肝组织标本作为对照组。所有标本均经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋,4 μm厚连续切片。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂兔抗人FHIT多克隆抗体、小鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗人P27蛋白单克隆抗体和PV-6000二步法免疫组化检测试剂盒均为即用型产品,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2 免疫组化操作按PV-6000试剂盒说明书进行。染色步骤:组织切片常规脱蜡、水化;3% H2O2去离子水孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶,PBS缓冲液冲洗;分别滴加兔抗人FHIT多克隆抗体、小鼠抗人PTEN单克隆抗体,室温过夜,PBS缓冲液冲洗,2 min×3次;滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体,室温孵育20 min,PBS缓冲液冲洗,2 min×3次;应用DAB溶液显色;蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。同时用PBS代替一抗作为染色的阴性对照,用已知的染色阳性切片作阳性对照。
1.3 结果判断标准
1.3.1 FHIT结果判定参考文献报道的方法观察FHIT蛋白的分布及阳性率[3]。先按染色强度打分:0分为无色;1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色 ......
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