大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究(2)
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1.2.2 分离方法
1.2.2.1 手术灌注室温在25～30℃,乙醚麻醉,碘伏消毒大鼠腹部,“U”形打开腹腔暴露肝脏,门静脉插管,前灌注液39℃灌注(20 ml/min)至肝脏完全变白(输液管前端以1 ml肝素稀释液代替),40℃链酶蛋白酶液和37℃胶原酶液(5～10 ml/min)离体循环灌注各约0.5 h。
1.2.2.2 再次消化将肝脏移入超净工作台已硅化的培养皿中,去掉被膜,小剪刀剪碎,倒入盛有振荡液的硅化三角瓶中,水浴摇床振荡0.5 h(200～250次),向三角瓶内加入4℃的DMEM液20 ml、DNA酶液10 ml,搅拌2～3 min,静置1 min(瓶子里的残骸下沉),静置后上清液用200目筛网过滤,过滤液滤至2个50 ml的离心管中。
1.2.2.3 离心过程向上述步骤中的每一个离心管内加D-Hank液至45 ml,旋转混合。10～15℃、1 700 r/min离心5 min。弃上清,2管合为1管,加DNA酶液5 ml,加D-Hank液液至45 ml,充分轻轻吹打,离心弃上清,再重复1遍。弃上清,加DMEM约7.5 ml,混匀悬液。
1.2.2.4 装载密度梯度备一个50 ml的离心管装载Nycodenze密度梯度,先加入10.387%的Nycodenze 12 ml,再将吸管深入到试管底部缓慢匀速加入18.8%的Nycodenze 10 ml,再在液面上缓慢加入“1.2.2.3”中的悬液,20 000 r/min离心25 min,10℃缓慢加速离心后,可见上面的一层白色细胞层为未活化的星状细胞层。小心吸取至2个15 ml的离心管内。
1.2.2.5 洗涤提纯HSCs向“1.2.2.4”中的15 ml离心管内加新鲜DMEM至12 ml,充分吹打混悬,洗涤3次,用含20%胎牛血清的DMEM悬浮,40× g离心[10],弃沉淀 ......
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