参蛇偏瘫胶囊联合尼莫地平预处理对脑缺血后再灌注神经细胞凋亡的影响(2)
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1.2.2 给药与取样模型组给予脑缺血5 min后再灌注72 h，尼莫地平组在缺血前30 min静脉给予尼莫地平0.2 mg/kg；参蛇偏瘫胶囊组在缺血前30 min腹腔注射参蛇偏瘫胶囊混悬液10 ml/kg；联合组缺血前30 min腹腔注射参蛇偏瘫胶囊混悬液10 ml/kg，同时给予静脉注射尼莫地平0.2 mg/kg。假手术组仅分离颈部血管，各组均在脑缺血后5 min再灌注72 h后取脑组织。
1.2.3 凋亡细胞检测依据Gavrieli等[6]描述的方法将DUTP生物素化后标记到DNA片段上，该生物素通过与亲合素的特异性结合，使该联合体结合在DNA的断点部位，加入过氧化物酶显色底物二氨基联苯胺(DAB)后，在原位出现棕褐色沉淀，着色者为凋亡细胞。
1.2.4 Bcl-2检测Bcl-2 多抗孵育后，依次滴加抗兔IgG、链霉卵白素(辣根酶标记)等试剂后孵育。阴性对照是用正常血清代替一抗，以已知阳性切片为阳性对照。观察Bcl-2免疫组化结果，根据文献[7]判定，阳性细胞的征象是胞浆内或核膜上出现棕黄色斑片或颗粒。高倍显微镜视野记计数200个神经元细胞中的阳性细胞比例，其中阴性为无神经元细胞着色，弱阳性<25%着色，中强度阳性25%~50%着色，反应强度分别记0、1、2、3分。
1.3 统计学方法
应用SPSS 10.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，方差不齐时采用近似t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组预处理后着色细胞变化的比较
见表1。由表1可知，联合组着色细胞率明显低于其他组(P<0.05)，假手术组无阳性细胞表达；尼莫地平组和参蛇偏瘫胶囊组着色细胞率低于模型组(P<0.05)，但与联合组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 各组预处理后Bcl-2表达变化的比较
见表1。由表1可知，模型组鼠皮质区锥体细胞呈弱阳性，而联合组皮质区Bcl-2蛋白免疫反应为强阳性，两组比较，差异有高度统计学意义(P<0.01)，与尼莫地平组、参蛇偏瘫胶囊组比较，差异也有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。
3 讨论
凋亡是脑缺血损伤后神经细胞死亡的重要方式，且多发生在缺血再灌注24 h后，是迟发性神经元死亡的主要形式。细胞凋亡需要多种基因、蛋白的参与，其特征是DNA的有序降解，TUNEL法可较早地、高度敏感地发现这些片段[8]。因此本实验采用TUNEL法检测动物皮质区缺血再灌注后的细胞凋亡情况。本研究结果显示，脑缺血再灌注后出现皮质区锥体神经元的丢失现象，大量凋亡细胞呈现，提示细胞凋亡与迟发性神经元死亡的密切关联。
研究表明，Bcl-2在抗细胞凋亡作用中发挥重要作用，这种作用是多途径的[9]。Bcl-2的蛋白表达量与脑保护作用成正比。本研究结果表明，尼莫地平预处理组的Bcl-2蛋白反应强度大于假手术组，提示采用尼莫地平进行预处理有可能导致Bcl-2基因表达增强，从而减少凋亡细胞数。既往药理学研究成果显示，参蛇偏瘫胶囊君药人参的成分对脑缺血损伤具有较好的保护作用，本研究结果亦提示参蛇偏瘫胶囊对鼠脑缺血起到了保护作用。通过以上的分析，推测这种保护作用机制可能与其增强Bcl-2的表达和抑制BaX蛋白的表达，在某种程度上干预了细胞凋亡进程有关。
参蛇偏瘫胶囊与尼莫地平联合使用是否会产生协同效应，本实验通过比较经两者单独使用及联合预处理后的皮层区神经元的凋亡细胞百分率，可以看出参蛇偏瘫胶囊联合尼莫地平预处理的效果由于二者单独使用。这提示，药物联合应用可能是脑缺血损伤治疗的一条有效模式。
[参考文献]
[1]张振强,荆志伟,樊小勇,等.参蛇偏瘫胶囊对局灶脑缺血大鼠脑保护作用的实验研究[J].中成药,2006,28(9):1059-1060.
[2]荆志伟,韩群英,张振强,等.参蛇偏瘫胶囊预防短暂性脑缺血发作的随机对照研究[J].辽宁中医杂志,2006,33(6):641-642.
[3]Basuroy S, Bhattacharya S, Leffler CW, et al. Akt/Bcl-2 signaling is critical for anti-apoptotic effects of carbon monoxide (CO) against TNF-alpha-mediated inflammatory damage in cerebral vascular endothelial cells [J]. FASEB J,2010,24(4):979.
[4]Zea Longa E, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke,1989,20(1):84-91 ......
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