三种肌松药对人离体静脉血中性粒细胞CD11b表达的影响(2)
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1 资料与方法
1.1 试剂与仪器
顺苯磺酸阿曲库铵(批号：10030713，江苏恒瑞医药股份有限公司，中国)，哌库溴铵(批号：A78048A，匈牙利吉利大药厂，匈牙利)，维库溴铵(批号：100302.1，浙江仙琚制药股份有限公司)脂多糖(LPS，批号：029k4023，Sigma公司，美国)，FITC标记Mouse Anti-Human CD11b 抗体(批号：4AH110912F，北京四正柏生物科技有限公司)，电热恒温水温箱(上海医用恒温设备厂)，FACSCalibur型流式细胞仪(Becton Dicknson公司，美国)，可调定量加液器(上海求精玻璃仪器厂)，XW-80A涡旋混合器(上海精科实业有限公司)，LD5-2A型低速离心机(北京医用离心机厂)，一次性使用负压采血器(山东永康公司)。
1.2 受试对象
年龄20～40岁，体重55～75 kg，ASA Ⅰ级、无吸烟史、无感染及免疫系统疾病、近期(1周内)未服用影响免疫功能的药物，男性和女性各5例。
1.3 实验分组
采用随机区组设计，实验分为14组，空白组[K]；静息无刺激下药物各组[J]{顺阿曲库铵1，2浓度组；哌库溴铵1，2浓度组；维库溴铵1，2浓度组}；脂多糖(LPS)组[L]；刺激下药物各组[C]{三种1，2浓度肌松药分别添加脂多糖组}。
1.4 实验步骤与检测
取上述抗凝全血，每份血样均同时分配于上述各处理组，各组每例加入100 μl全血；而后，空白组[K]及LPS组[L]添加生理盐水100 μl对照，其余各组分别加入相应浓度药物100 μl达到对应终浓度；把上述各组样品放入37℃恒温箱避光孵育1.5 h。[L]和[C]下各组加入终浓度为1 μg/ml的脂多糖100 μl，[K]和[J]下各组添加生理盐水100 μl对照；各样品继续入37℃恒温箱避光孵育2 h；随后，取上述样品加入10 μl FITC标记 CD11b 抗体，室温避光孵育20 min，加入2 ml红细胞裂解液(BD公司，美国)混匀后避光放置10 min，样品离心5 min弃上清，沉淀用PBS洗2次，0.5 ml PBS重悬细胞后，流式细胞仪上机检测[1-2]。用PMN上CD11b平均荧光强度来表示CD11b的表达水平，用CELLQuest 软件进行分析。
1.5 统计学处理
采用SPSS 18.0 统计软件进行秩和检验，Friedman检验，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
统计学分析显示，静息组(前7组)与激活组(后7组)均数比较有统计学意义(P<0.05)，静息组与激活组二者分别进行组内比较均无统计学意义(P>0.05)；多个样本均数间的两两比较显示：哌库溴铵低浓度组和空白组比较有统计学意义(P<0.05)，哌库溴铵高浓度组与维库溴铵低浓度组比较有统计学意义(P<0.05)，哌库溴铵高浓度组与低浓度租比较有统计学意义(P<0.05)。维库溴铵低浓度组与空白组比较有统计学意义(P<0.05)， 维库溴铵低浓度组与顺阿曲库铵低浓度组比较有统计学意义(P<0.05)，其余各组比较均无统计学意义(P>0.05)。
分析表明,与空白组比较，低浓度维库溴铵和低浓度哌库溴铵均可下调静息状态CD11b的表达。哌库溴铵高低浓度间表达有差别，但与空白组比较均无明显差异。顺阿曲库铵低浓度组与维库溴铵低浓度组有差别，但顺阿曲库铵两浓度组与空白组比较均无明显差异。三种肌松药对LPS激活状态下的PMN表面CD11b表达均无明显差异。
3 讨论
CD11b/CD18是白细胞整合素亚家族中的一员，CD11b/CD18是α，β异二聚体， 以非共价键连接，CD11a、b、c均共用CD18这条β链，而CD11b/CD18是中性粒细胞最主要的整合素局限在白细胞上表达，主要分布于PMN、单核-吞噬细胞和某些淋巴细胞表面，可参与补体结合和吞噬调理，并在PMN和单核细胞与内皮细胞的黏附过程中发挥重要作用，进而参与免疫炎症反应[3]。有报道，CD11b表达上调还可抑制PMN凋亡[4]。本实验研究证实CD11b主要表达于PMN表面，单核细胞及淋巴细胞表面仅有少量表达，进一步表明CD11b与中性粒细胞联系密切。
本实验采用文献报道的微量全血流式细胞技术测定PMN表面 CD11b 的表达，尽可能接近生理全血环境[1-2]，实验设定的三种肌松药物的两浓度也基本接近麻醉诱导和维持浓度[5]。本实验研究发现低浓度哌库溴铵和维库溴铵在静息状态下可抑制CD11b表达，但对LPS激活状态下的CD11b表达无影响，可能与实验中LPS激活作用过强、时间过长有关。同时发现静息无LPS刺激状态下包括空白组在内各组整体均数普遍较文献报道有所抬高，可能是实验进程中采用振荡器摇匀机械刺激所致，这与文献报道机械刺激可加速CD11b表达一致[6]。本研究进一步表明：麻醉药对CD11b表达的抑制与PMN 所处的状态、用药剂量以及用药时机有关[1-2]，但药物与抑制效应间无剂量相关性，即增加药量抑制效应不会相应增强[7]。本实验研究的三种肌松药是当今临床应用最为普遍的三种中长效非去极化肌松药，本次小样本资料研究结果发现前两种甾体类肌松药可抑制静息状态的PMN表面CD11b的表达，这是否与肌松药过敏反应有关，文献多数报道维库溴铵、哌库溴铵、顺阿曲库铵组胺释放作用很少[8-9]。也有报道高浓度的顺阿曲库铵皮内实验可引起风团反应和轻中度肥大细胞脱颗粒反应[10]。近来研究发现肌松药引起的过敏反应与CD63、CCR3、CD11b的表达呈现相关性[11-12]。CD63不仅表达于嗜碱粒细胞，还表达于PMN表面并参与PMN活化和内皮黏附功能。肌松药导致的过敏反应推测可能与围术期创伤激活炎症反应导致外周血中细胞因子释放增加[13-14]，进而影响CD11b、CD63的表达和激活有关，但在肌松药未导致过敏现象时CD11b和CD63的表达有何种相关尚不清楚，可能有多种中间机制调节其免疫稳定性 ......
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