皮肤组织中SOD活性测定的样品制备方法
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[摘要] 目的：确定应用黄嘌呤氧化酶法测定皮肤组织中SOD活性的生物样品处理方法。方法：用不同的条件制备生物样品后进行皮肤组织中SOD活性的测定。结果：皮肤组织中SOD活性测定的最佳生物样品处理条件是将皮肤组织的匀浆液以0℃，3 000 r/min离心10 min制备得到粗酶液。结论：本研究建立测定皮肤中SOD活性的方法，为评价药品和化妆品对皮肤组织抗氧化、延缓皮肤衰老的功能奠定了基础。
[关键词] 大鼠；皮肤组织；黄嘌呤氧化法；SOD活性；中药
[中图分类号] R986[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)11(b)-027-02
Preparation of the bio-sample in the determination of skin SOD activity
PAN Weisong1, XIAO Ying2,3, LI Wei1
(1.Guangzhou Institute for Drug Control, Guangzhou 510610, China; 2.Department of Pharmacy, Ji′nan University, Guangzhou 510632, China; 3.Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drugs Research, Guangzhou 510632, China)
[Abstract] Objective: To study the optimal situation of the xanthine oxidase method to determine the SOD activity in the skin tissure. Methods: Compared the different situation of the determination of the SOD in the rat′s skin. Results: The optimal situation was centrifuged at 0℃，3 000 r/minfor 10 minutes. Conclusion: The determination of SOD activity is available with the method. The study finds the basis to evaluate the function of the drug or the cosmetics to anti-oxdization and anti-senility in the skin tissure.
[Key words] Rat; Skin tissure; Xanthine oxidase method; SOD avtivity; Chinese medicine
超氧化物歧化酶(SOD)是生物机体内重要的自由基清除酶，其活性的高低表征着机体的抗氧化能力和衰老程度。目前实验室里比较普遍的SOD测定方法是黄嘌呤氧化酶法[1]。病理改变的过程中，机体功能改变一般是先于结构变化的，因此评价化妆品和药物是否确实能够延缓皮肤组织的衰老，皮肤组织中的SOD活性是一个有意义的评价指标。由于皮肤组织中SOD活性测定方法的报道较少，目前市面上SOD试剂盒也无法直接测出大鼠皮肤组织中SOD酶的活性，因此本研究以南京建成生物工程公司的SOD试剂盒为基础，建立了测定皮肤组织中SOD活性的方法，为评价化妆品、保健品和中药的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠 6只，由广州中医药大学实验动物中心苏小茹老师提供；动物合格证号：粤监证字2005A008。
1.2 仪器和试剂
电动玻璃匀浆器(江苏金坛市佳美仪器厂)；SCJ10005低温高速离心机；紫外分光光度计(CARY 100)；恒温水浴(GRANT SUB14)；MSI旋涡混合器(广州 IKA 公司)；SOD试剂盒(南京建成生物工程公司，批号：20070126)；牛血清白蛋白(Biotech 级，AMRESCO公司，批号：303903A)；其他试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 方法
大鼠取皮肤组织约0.5 g，加预冷的生理盐水，置电动玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆8 min，制成10%的皮肤匀浆液。将匀浆液平分成两份，分别以3 000 r/min，0℃离心10 min和15 min，所得上清液即为粗酶液。然后分别取粗酶液加入底物溶液，以旋涡混合器振荡0.5 min，使之混合均匀后置37℃恒温水浴40 min后，取出加入显色剂，在旋涡混合器上混匀，室温放置10 min后，在550 nm处测定吸光度。同法平行制备空白管，作为空白对照。以对照管吸光度减去反应管吸光度的差值比上对照管吸光度值的结果计算SOD的活性。粗酶液以考马斯亮蓝法[2]测定其中蛋白含量，以牛血清白蛋白溶液做标准曲线。
2.2 结果
不同测定条件下SOD酶的百分抑制率见表1。6个不同条件下的SOD酶的百分抑制率均为15%～55%。蛋白定量的标准曲线：Y＝1.783 4X-0.136 6(r＝0.991 5)，线性范围为0.2～1.6 mg/ml。各个条件下的粗酶液的蛋白含量见表2。由表1、2可知，在转速为3 000 r/min时，离心时间的长短对粗酶液中蛋白含量没有明显的影响。
3 讨论
药品评价正日益受到重视，针对药品，保健品和化妆品的安全性和有效性、功能性评价得到了广泛开展[3-6]。目前国内药品、保健品和化妆品对抗皮肤衰老功效评价的实验研究尚少见报道。笔者在进行有关中药抗皮肤衰老的评价时，选择测定皮肤组织中SOD酶的活性来评价此类中药的功效。经过比较市面上现有的SOD试剂盒后，笔者选择了南京建成生物工程公司生产的SOD试剂盒来测定大鼠皮肤组织中的SOD活性。预实验发现，如果完全按照试剂盒说明书的要求，取30～50 μl所制备的1%皮肤组织匀浆液将无法测出SOD活性。因此本研究通过改进样品处理方法以建立测定皮肤组织中SOD活性的方法 ......
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