小鼠胃和阑尾组织中h-CD降解规律与死亡时间的相关性研究(2)
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参见附件(3119KB，3页)。
1.2 免疫印记检测
分别称取100 mg胃和阑尾组织，加入1 ml裂解液(RIAP)和10 μmol/L蛋白酶抑制剂(PMSF)。加入适量液氮，在研钵中充分研磨。将组织匀浆后抽取500 μl，4℃ 12 000×g离心30 min，移取上清液测蛋白浓度后置于-80℃冰箱中备用。取20 μg蛋白样品，在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中垂直板电泳，80 V，20 min浓缩胶，120 V， 70 min分离胶。用水平电泳槽将凝胶进行电转移100 V，50 min，将蛋白转移至硝酸纤维素膜(购自武汉博士德生物工程有限公司)上。将含有蛋白质的硝酸纤维膜用TBST脱脂奶粉封闭，平缓摇动过夜，按1∶300加入caldesmon单克隆抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，室温下1 h，TBST洗膜10 min×3次，按1∶400分别加入二抗，室温下1 h，TBST洗膜10 min×3次。然后分别加入等体积发光剂(购自北京普利来基因有限公司)和增强剂反应1 min，分别对二者进行检测后，柯达(KODAK Image station 440)全自动显影系统显像。免疫印迹法结果进行图像扫描后采用Image proplus 5.0测出各条带的积分光密度值(integrate optical density，IOD)。实验数据用均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS 16.0软件对数据进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
Western-blot检测可见，存放于4℃和25℃温度条件下的小鼠胃、阑尾组织中的h-CD的含量均随死亡时间的延长而逐渐减少(图1、2)，且变化趋势表现出一定的规律性，四组条带颜色均随死亡时间的延长而逐渐变浅，同一时间点处，25℃条件下，胃和阑尾中h-CD的含量明显少于4℃条件时h-CD的含量，而在温度相同的条件下可见，h-CD在阑尾组织中的降解速度快于其在胃组织中的速度。
图1 4℃条件下小鼠死后胃和阑尾组织不同时间段
h-CD免疫印记结果
Fig.1 Western-blot of h-CD content in stomach and appendix tissues of mice within 120 h after death in 4℃
图2 25℃条件下小鼠死后胃和阑尾组织不同时间段
h-CD免疫印记结果
Fig 2.Western-blot of h-CD content in stomach and appendix tissues of mice within 120 h after death in 25℃
IOD值分析结果显示：在α=0.05检验水准下，4℃条件时，对胃组织在各时间点时h-CD的含量与相邻上一时间点时h-CD的含量进行检验，t值依次为45.205、57.429、62.799、110.229、78.282，可得P值均小于0.05，具有统计学意义；对阑尾组织进行相同的检验，t值依次为43.171、51.382、275.094、121.302、60.061，P均<0.05，差异具有统计学意义。25℃条件时，对胃组织进行相同检验，t值依次为9.132、15.684、59.941、63.392、51.878，P均<0.05，差异有统计学意义；对阑尾组织进行相同的检验，t值依次为115.429、187.980、178.497、83.328、55.579，P均<0.05，差异具有统计学意义。由上述分析可知，各组中h-CD的含量均随时间的延长而减少。见表1。各时间点h-CD含量的相对变化以死后不同时间点h-CD含量占死亡即刻含量的百分数来反应，在α=0.05检验水准下，4℃条件时，对胃和阑尾组织中h-CD含量百分数进行检验，t值依次为6.231、13.115、70.779、65.209、31.674，P均<0.05，差异具有统计学意义；在25℃条件时检验，t值依次为4.430、45.632、62.525、47.156、22.517，P均<0.05，差异具有统计学意义。对胃组织4℃组和25℃组的数据进行检验，t值依次为1.173、30.356、77.813、105.650、85.777，可知除死后24 h 4℃组和25℃组数据无统计学意义(P=0.294)外，其余P均<0.05，差异具有统计学意义；对阑尾组织中各数据进行上述检验，t值依次为15.570、210.634、85.413、137.843、126.440，P均<0.05，差异具有统计学意义。分析数据可知25℃组胃和阑尾组织h-CD降解速度均高于4℃组，且在同温度比较中阑尾组织中h-CD降解速度均高于胃组织的降解速度。见表2。
表1 小鼠死后不同时间不同温度h-CD的IOD值(x±s)
Tab.1 The IOD values of h-CD of mouse in the different time and temperature (x±s)
与上邻组比较，#P<0.05
Compared with up group in the same temperature and tissue, #P<0.05
表2 小鼠死后不同时间段h-CD含量的相对变化(x±s，%)
Tab. 2 The relative content changes of h-CD of mouse in different time and temperature (x±s, %)
同温度不同组织间比较，*P<0.05；同组织不同温度间比较，#P<0.05
Compared with different tissues in the same temperature, *P<0.05; compared with different temperature in the same tissue, #P<0.05
3 讨论
h-CD存在于正常平滑肌细胞和软组织平滑肌肿瘤[2]及多种骨肿瘤中[3]，它可以起到抑制肌球蛋白Mg-ATP酶活性的作用，还可以抑制平滑肌磷酸化肌球蛋白所引发的肌动蛋白丝的移动[4-6]，是一种重要的调节蛋白 ......
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