羟基喜树碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响(2)
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参见附件(2826KB，3页)。
1.1.2 细胞株MCF-7细胞株购自中科院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养并传代。
1.1.3 分组取对数生长期的MCF-7细胞，细胞传代后分为羟基喜树碱处理组(10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)和未经羟基喜树碱处理的对照组。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测细胞增殖取对数生长期的MCF-7细胞种于96孔板上，每孔200 μl，细胞密度为2×104/ml，细胞贴壁后更换含不同浓度羟基喜树碱的培养液，对照组加等体积的培养液，每组设6个复孔。将细胞置于37℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养48 h，每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，置于摇床上振荡10 min充分溶解以结晶，用酶标仪在492 nm处测各孔的光密度值(OD)，然后计算羟基喜树碱对细胞的生长抑制率，生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。
1.2.2 Hoechst33258染色检测细胞凋亡荧光显微镜观察：取对数生长期的MCF-7细胞，按照分组要求制备细胞爬片，根据Hoechst33258染色试剂盒说明书对细胞进行染色，将细胞爬片置于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。
1.2.3 Caspase-3在MCF-7细胞中的表达水平按照1.2.1中的方法培养细胞，按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，测定RNA的浓度和纯度并观察其完整性。取1 mg总RNA进行20 ml逆转录反应；再取得到的cDNA行25 ml PCR反应。Caspase-3上游引物为：5’ATGGACAACAACGAAACCTCCGTG3’，下游引物：5’CCACTCCCAGTCATTCCTTTAGTG3’，扩增片段长度为857 bp。PCR反应条件：94℃ 5 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s。进行30个循环，最后72℃延伸1 min。所得PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，并对条带进行光密度扫描分析。
1.3 统计学方法
经SPSS 12.0软件分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05视差异有统计学意义。
2 结果
2.1 羟基喜树碱对MCF-7细胞增殖的影响
见表1。
表1 羟基喜树碱对MCF-7细胞增殖的影响(x±s，n=6)
Tab.1 Effect of HCPT on the proliferation of MCF-7 cells (x±s，n=6)
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与10 μmol/L羟基喜树碱处理组比较，△P<0.05，△△P<0.01
Note：Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with 10 μmol/L HCPT group, △P<0.05, △△P<0.01
由表1可见，与对照组比较，50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L羟基喜树碱对细胞增殖均有抑制作用(P<0.05、P<0.01)，尤以200 μmol/L组的抑制作用最明显。各羟基喜树碱处理组抑制率比较，100 μmol/L及200 μmol/L组较10 μmol/L抑制率差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，而50 μmol/L差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 羟基喜树碱对MCF-7细胞凋亡的影响
100 μmol/L及200 μmol/L羟基喜树碱处理组中可见典型的凋亡形态学改变：细胞核中的染色质高度浓缩，可见核碎裂和凋亡小体，10 μmol/L、50 μmol/L组未出现明显的凋亡改变。对照组中细胞核则呈弥散均匀的荧光。见图1。
图1 羟基喜树碱诱导MCF-7细胞凋亡形态学改变(×400)
(A：对照组；B：100 μmol/L羟基喜树碱处理组；
C：200 μmol/L羟基喜树碱处理组)
Fig.1 The morphological change of MCF-7 cells
after treated with HCPT (×400)
(A: control group；B: 100 μmol/L HCPT group；
C: 200 μmol/L HCPT group)
2.3羟基喜树碱对MCF-7细胞Caspase-3表达水平的影响
见图2及表2。
图2 PCR电泳测定MCF-7细胞Caspase-3的表达
(M：Marker；1：对照组；2：10 μmol/L羟基喜树碱处理组；3：50 μmol/L羟基喜树碱处理组；4：100 μmol/L羟基喜树碱处理组；5：200 μmol/L羟基喜树碱处理组)
Fig.2 Expression of Caspase-3 in MCF-7 cells
determined by PCR electrophoresis
(M: Marker；1: control group；2: 10 μmol/L HCPT group；3: 50 μmol/L HCPT group；4: 100 μmol/L HCPT group；5: 200 μmol/L HCPT group)
表2 RT-PCR测定MCF-7细胞Caspase-3 mRNA
表达结果分析(x±s)
Tab.2 Analysis of RT-PCR results of Caspase-3 mRNA ......
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