伽玛射线对人垂体瘤细胞细胞周期和抑癌基因p16表达的影响(2)
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10份标本随机分成1组对照组和4组照射组，每组均有2份标本。照射组根据照射剂量分为照射1~4组，其中照射1组伽玛刀照射中心剂量2 Gy(周边剂量1.5 Gy)，2~4组以及对照组的照射中心剂量和周边剂量分别为5 Gy(3.75 Gy)、8.22 Gy(6.0 Gy)、13.33 Gy(10 Gy)和0(0)。
所有标本先在头部MRI(3.0)定位后置于旋转伽玛刀治疗机上照射，照射野为直径4 mm的球体，照射方式为等中心照射，照射深一个射点。照射完毕后部分细胞悬液离心，加入培养液，常规培养48 h，每组2份标本分别进行下一步实验。
1.4 流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡率
随机取各组1份标本，消化，离心，弃上清，PBS洗1次，离心，弃上清，用70%冷乙醇固定24 h后用PBS清洗，除去乙醇，加入Rnase(0.5 mg/管)，37℃，30 min，冷却，PI染色15 min，暗室放置，应用FACS-scan 440型流式细胞仪, 激发波长为488 nm，发射波长为585 nm，测定前以鸡血红细胞为标准样品，调整仪器变异系数(CV)值<5%，测定DNA含量，独立重复5次实验，根据DNA分布的直方图，用多项式拟合法计数细胞周期各时相的百分比。同时，采用DNA细胞周期分析程序，计算凋亡细胞DNA断裂百分率。
1.5 Western Blot法检测p16蛋白在各组表达特点
取各组1份标本，放入预冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干称重，以重量(g)/体积(ml)=1∶9 加入预冷的组织蛋白提取液，用玻璃匀浆器研磨成组织匀浆，低温离心机4℃ 15 000 r/min，离心15 min。收集上清，以考马斯亮蓝法进行蛋白定量，经10% SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜后的硝酸纤维素膜经漂洗后用5%脱脂奶粉阻断非特异性结合，以封闭液分别稀释兔抗人p16单克隆一抗体(1∶1 000)，按每cm2膜加入 0.1 ml 相应的每一抗体溶液，封膜机封口，4℃过夜，然后分别放入用封闭液按1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，最后在暗室中进行化学发光法显影。高敏感胶片(Sigma)摄片、洗片。蛋白带测定光密度(OD)值，β-actin作为内参照。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件处理，各组标本检测值均以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 FCM检测伽玛刀射线对垂体瘤细胞周期和凋亡率的影响
FCM检测结果显示，照射1组中心剂量2 Gy对细胞周期和细胞凋亡率影响不明显，而照射2组和照射3组中心剂量分别为5 Gy和8.22 Gy时，G0/G1期和G2/M期细胞随剂量增多比例升高，细胞凋亡率升高，而S期细胞逐渐减少，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，当中心照射剂量达13.33 Gy时，S期细胞明显增多，细胞凋亡率下降，见表1。
表1 不同照射剂量作用垂体瘤细胞周期、细胞凋亡率
和c-myc蛋白表达的变化(x±s)
注：与对照组比较，*P<0.05
2.2 不同照射剂量作用下垂体瘤抑癌基因p16蛋白的表达比较
不同伽玛刀照射中心剂量作用下垂体瘤细胞中p16蛋白表达不一致，在对照组和照射1组表达量无明显改变，照射2组和3组中随剂量增加，表达量升高，与对照组差异均有统计学意义(P<0.05)，照射4组中p16蛋白表达量下降。
3 讨论
细胞周期通常是指从通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程[1]。连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段[2]。正常细胞DNA在受到放射线和化疗药物损伤后，将启动细胞周期检测点，使细胞停滞于G1期、S期、G2/M期各个细胞周期检测点，进行损伤后修复[3]。肿瘤的放疗可以改变细胞周期，电离辐射可改变细胞周期的进程[4]。细胞周期阻滞是辐射引起的重要生物学改变。在正常细胞有丝分裂周期中存在G1/S期和G2/M期两个限制点，严格控制着细胞有丝分裂的启动和完成。当辐射等因素损伤细胞基因时，两个限制点可以分别通过延迟G1期和(或)G2期，保证细胞能够完成复制前和有丝分裂前的基因修复，当基因损伤超过细胞修复能力时，限制点则促进细胞的凋亡，从而确保高度忠实于亲代的细胞复制[5]。
本实验发现当伽玛刀照射中心剂量在2 Gy时，人垂体瘤细胞各细胞周期比例并没有明显变化，但是当剂量在5 Gy和8.22 Gy时，G0/G1期和G2/M期细胞比例增多，尤其是发生G1期阻滞现象，随着射线剂量增多，G2期阻滞现象明显，细胞凋亡率升高。当中心剂量为13.33 Gy时，出现S期细胞增多，且细胞凋亡率下降，细胞凋亡率下降可能与照射剂量过大导致大量细胞坏死，凋亡细胞比例下降有关。Kalassen[6]认为凋亡是一个需要基因表达，蛋白质合成和能量的主动过程，触发凋亡剂量远远低于造成坏死所需的剂量，照射剂量超过10 Gy足以破坏基因转录或细胞内外离子平衡，因而凋亡程序不能启动。本实验照射中心剂量>13.3 Gy组垂体瘤细胞凋亡率出现下降，同样说明单次照射剂量>10 Gy已达到垂体瘤细胞致死剂量，而照射剂量在5 ~10 Gy之间则可引起细胞凋亡，照射剂量<5 Gy则不能启动凋亡的发生。
p16基因又叫多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor, MTS)是近年发现的直接参与细胞生长增殖负调控的抑癌基因[7]。目前认为，p16基因是对细胞周期影响最大的抑癌基因，直接作用于细胞周期的抑癌基因，是G1期重要的调控因子，具有阻止损伤的DNA进行修复、促进细胞凋亡的功能[8]。Machiavelli-Rea等[9]学者发现p16基因参与垂体瘤生长过程。Jaffarain等[10]对31例垂体瘤p16基因多态性进行了研究，发现垂体瘤中p16基因5’CpG岛甲基化率高达83.3%。而在正常垂体组织中均无p16基因甲基化现象，提示p16基因甲基化失活对垂体瘤的发生起重要作用。
本实验发现中心剂量在5 Gy和8 ......
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