一种类凝血酶制剂的人体药动学研究(2)
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2.2.2 血清HCA抗体效价采用琼脂糖(Agarose)双扩散法检查。抗体血清的效价>1∶32或接近 1∶64。
2.2.3 标记抗原(125I - HCA)制备与分离采用 Sephadex G-50柱(1 cm×30 cm) 分离纯化，标记反应液，全部上柱分离；收集标记抗原。
2.2.4 血样采集分别于给药前和给药后5 min、15 min、25 min、35 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h取静脉血，离心15 min(4 000 r/min)，分离上层血清于-70℃保存待测。
2.3 方法学确证
2.3.1专属性利用辽宁诺康生物制药有限责任公司提供的HCA制备的兔抗HCA多克隆(Polyclonal antibody)抗体血清，用标记抗原(125I-HCA)完成抗体结合曲线。结果见图1。结果表明，选择70%结合率时的抗血清滴度为1∶64。滴度越高抗血清中的抗体越少，同时抗血清中杂质干扰也越少，所建立起的RIA方法越理想。
2.3.2标准曲线的绘制使用新鲜配制125I-HCA液(标记抗原)、HCA标准液和将存放在-60℃低温冰箱中保存的正常人血清和待测血样在37℃水浴中解冻待用。HCA-RIA 空白标准曲线反应系统为 125I-HCA(标记抗原)、抗血清(抗体)和HCA(标记抗原)，37℃孵育0 min，4℃ 2 h，加分离试剂后4℃ 2 h，6 000 r/min离心10 min。吸净上清，测量剩余沉淀的放射性活度。
图1 尖吻蛇毒血凝酶放射性免疫分析标准曲线
Fig.1Standard curve of heamocoagulase agkistrodon-radioimmunoassay (HIA-RIA)
HCA-RIA复合正常人血清标准曲线反应系统为125I-HCA(标记抗原)、抗血清(抗体)和HCA(标记抗原)和一定量的正常人血清，加分离试剂后, 4℃ 2 h，6000 r/min离心10 min，测量剩余沉淀的放射性活度。
冻溶血样按标准曲线制备方法处理后，测定放射性活度。
按上述方法进行样品测定后表明，用RIA法测定人血清中 HCA的浓度范围在 0~50 μU/ml。
2.3.3 HCA-RIA精密度RIA精密度是指一个样品经反复测定的实际测量值的离散度，不是具体的数值或cpm数，其离散度越小，则能区别的样品量差别越小，也就是分析系统的精密度越高，通常以复管精密度RSD(%)表示，因为样品RSD(%)的大小与样品中待测物的含量有关，系统的精密度必须用不同待测物含量的样品的RSD(%)值制作出精密度图表示。图2为注射用尖吻蛇毒血凝酶-RIA精密度曲线，检测范围 100 μl血清样品中0~180 pg，40~100 pg时精密度最低，最低检测限可达20 pg/100 μl血清，有效测定范围应该为20~160 pg/100 μl血清。
图2尖吻蛇毒血凝酶放射性免疫分析精密度曲线
Fig. 2Precision curve of heamocoagulase agkistrodon-radioimmunoassay (HIA-RIA)
2.3.4 HCA-RIA准确度结果表明， HCA-RTA测定100 μl血清中HCA的20~140 pg精确度很高，回收率超过90.0%以上，有使用价值。
2.4 数据处理与药代动力学参数
采用DAS软件进行数据处理，确定最佳权重和最佳房室模型。根据确定的权重和房室模型，求出药代动力学参数，包括半衰期(t1/2)、分布容积(Vd)、清除率(CL)、血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-∞、AUC0-t)等。
2.5结果
2.5.1 血药-浓度时间曲线和药代动力学参数
单次静注注射用尖吻蛇毒血凝酶的体内过程经DAS软件分析符合二室模型，静脉注射1 U、2 U和4 U后的重要药代动力学参数见表1，统计矩参数、平均血药浓度拟合的参数见表2。平均血药浓度-时间曲线及静脉注射注射用尖吻蛇毒血凝酶后重要时相点的血药浓度比较见图3、4。
图3健康志愿者单次静脉注射注射用尖吻蛇毒血凝酶后
血药浓度-时间曲线
Fig.3 Mean serum concentration-time curves of heamocoagulase agkistrodon after a singledose of heamocoagulase agkistrodon injection in healthy volunteers
3 讨论
HCA-RIA质量控制是保障测定数据的可靠。减少自愿者的个体差异，保证给药的准确无误，取血时相准确，样品处理分装保存规范。样品HCA含量测定在标准曲线、精密度检验、整批实验的偏差、漂移和设定批间批内的质控样品等方面，以保证测定的误差在可接受的范围内。
药代动力学特征：单次静脉注射注射用尖吻蛇毒血凝酶的体内过程基本符合一级动力学二室模型；由于药时曲线出现多峰、尾点反跳等现象，药时曲线不典型(可能与给药剂量较低、检测方法灵敏度较高等因素导致检测误差较大有关)，因此按个体药时曲线拟合的房室参数变异性太大，不能真实反映该药的药代动力学特征，因此采用统计距参数、平均血药浓度拟合房室参数、药时曲线直观分析揭示该药在健康人体内的药代动力学特征。统计距参数和平均血药浓度拟合房室参数的AUC随给药剂量的增加而明显增大，显示其具有明显的剂量依赖关系，其相关系数r分别为0 ......
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