同型半胱氨酸检测试剂盒方法学评价
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[摘要] 目的：通过对同型半胱氨酸(Hcy)检测试剂盒(酶比色法)各种性能的测定，评价Hcy酶比色法检测的可靠性。方法：用本方法在日立7080全自动生化分析仪上对精密度、线性范围和抗干扰指标进行评价。结果：本方法的测定评价表明，该Hcy试剂盒批内变异系数为2.3%，批间变异系数为5.5%，线性良好，r=0.999 4。胆红素、乳糜(甘油三酯)和血红蛋白抗坏血酸对该试剂盒的测定结果无显著影响；抗坏血酸对该试剂盒的测定结果有一定影响，但仍在执行标准规定的范围内。结论：本方法测定结果准确可靠且操作简便，直接在全自动生化分析仪上使用，值得推广。
[关键词] 同型半胱氨酸；体外诊断试剂；方法学评价
[中图分类号] R446.1[文献标识码]B [文章编号]1673-7210(2011)04(a)-135-02
血浆同型半胱氨酸(又称高半胱氨酸，homocysteine, Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的中间产物。同型半胱氨酸在体内的分解代谢，受两方面因素影响最大。一是与先天遗传有关的某些生物酶的缺乏，另一个就是体内叶酸、维生素B6、维生素B12等营养元素的缺乏。这两种缺乏都会影响同型半胱氨酸转化为其他物质，导致高同型半胱氨酸血症。血浆Hcy的测定，对心血管疾病、尿毒症、动脉粥样硬化、糖尿病、老年痴呆症等疾病的判定中，有重要的临床意义[1]。
通常认为成人空腹血浆总Hcy水平正常值为4~12 μmol/L，理想值为<10 μmol/L，高于15 μmol/L则被认为是高同型半胱氨酸败血症；老年人(≥60岁)空腹血浆总Hcy水平正常值为15~20 μmol/L，高于20 μmol/L被认为是高同型半胱氨酸败血症[2]。
目前，实验室常用的Hcy测定方法有色谱法、酶联免疫法及荧光偏振免疫法。色谱法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆Hcy浓度的首选方法，但因色谱法(HPLC及GC-MS)需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用，而免疫测定法可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛欢迎[3]。
免疫测定法一般是通过ELISA法、荧光偏振免疫法和酶循环法进行检测[4]。本文是对一种在反应原理上有别于酶循环法，但是同样可以在生化分析仪上进行检测的试剂盒进行考察。
重庆本地某体外诊断试剂生产厂家自主研发的酶比色法的同型半胱氨酸检测试剂盒，用二硫苏糖醇还原样本中的氧化型同型半胱氨酸，再通过同型半胱氨酸甲基转移酶的作用将D-甲硫氨酸的甲基转移至同型半胱氨酸，从而生成D-蛋氨酸、L-蛋氨酸。随后，D-蛋氨酸在D-蛋氨酸氧化酶作用下生成氧化氢。过氧化物酶与显色剂10-(羟甲基氨羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠(简称DA-67)发生作用，生成亚甲基蓝显色，在660 nm有最大吸收，通过测定其吸光度变化值来计算出同型半胱氨酸的浓度。
1 仪器与材料
日立7080全自动生化分析仪。评价试剂：同型半胱氨酸检测试剂盒(酶比色法)，由重庆某体外诊断试剂生产厂家提供。 同型半胱氨酸质控品，北京九强公司生产(批号：08-0704)，质控范围10.2~13.8 μmol/L；批号(08-0926)，质控范围24.6~33.4 μmol/L。乳糜：西安立邦制药有限公司生产(批号：08031 12)；血红蛋白(牛血红蛋白)：北京经科宏达生物公司(批号：Sigma H-3760)；胆红素(Bilirubin, Mixed Isoners)：北京经科宏达生物公司(批号：Sigma A-7631)。
2 方法与结果
2.1 操作方法
试剂盒测定参数设置和操作严格按照试剂盒厂家说明书规定进行。
2.2 评价方法
按产品执行标准及WS/T 124-1999[5]对试剂的精密度、线性范围和抗干扰性进行评价。
2.3 精密度试验
2.3.1 批内变异系数取线性范围内一份定值血清，重复测定10次，测定批内CV，CV=2.3%。
2.3.2 批间变异系数取有效期内3个不同批号的试剂，分别对同一份定值血清进行3次重复测定。用3份试剂分别测量的平均值和总平均值计算批间相对极差，批间相对极差=5.5%。
2.4 线性范围
说明书规定线性范围为3~50 μmol/L。分别取12.0、29.0 μmol/L的质控品并用稀释或加倍的方法达到6.0 μmol/L和55.4 μmol/L作为线性范围测定的理论值。每个浓度测定3次取平均值，与理论值进行回归计算，r=0.999 4。
图1 Hcy试剂盒线性试验
2.5 干扰试验
在质控血中分别加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表1的要求，然后测定Hcy的含量。试验结果表示，加入规定量的胆红素、乳糜和血红蛋白后，与对照组比较[6]，结果差异无统计学意义，这三种干扰物对该同型半胱氨酸检测试剂盒的检测均无明显干扰。加入规定量的抗坏血酸后，结果与对照组比较有差异，干扰率为8.36%，仍能达到执行标准规定的要求。
表1 Hcy检测试剂盒抗干扰性能
注：与对照组比较，*P>0.05；#P<0.05
3 讨论
与市面其他同类体外诊断试剂产品的技术参数要求比较，该同型半胱氨酸检测试剂盒在精密度、线性范围和抗干扰的测定均能达到满意效果，并且酶比色法的线性范围(3~50 μmol/L)远高于ELISA法的Hcy检测试剂盒的线性范围(一般低于20 μmol/L)，更适应临床检测，更具有市场优越性，便于在临床上推广使用。
该试剂盒为3试剂配方，对检测仪器要求较高，一般的半自动生化分析仪不能够使用该试剂盒进行检测，必须配合全自动进口生化分析仪。在试剂配方方面，仍有改进的余地。
胆红素、乳糜(甘油三酯)和血红蛋白抗坏血酸对该试剂盒的测定结果无显著影响，抗坏血酸对该试剂盒的测定结果有一定影响，但仍在执行标准规定的范围内。
未进行准确度的测定，是因为医院实际使用试剂盒的时候，一般根据定期做质控的值由厂家对准确度进行调节 ......
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