类风湿关节炎患者外周血白细胞介素-23和类风湿因子的表达研究(2)
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1.2 临床标本的采集
所有研究对象采集空腹静脉血2管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于分离外周血单个核细胞(PBMC)。第二管无抗凝剂3 ml，静置30 min，离心后取血清，用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-23和免疫比浊法检测血清RF水平。
1.3 外周血单个核细胞的分离
抽取3 ml淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司)于无菌离心管中，将新鲜无菌留取的3 ml肝素抗凝血用等体积(3 ml)无菌生理盐水(1∶1)稀释后，缓慢加入到已装有淋巴细胞分离液的离心管中，水平离心机离心(2 000 r/min，20 min)，吸取中间的白膜层(PBMC)，用5倍体积的无菌生理盐水洗涤2次，最后用无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×107/ml。
1.4 RNA 提取和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1.4.1 RNA提取 将上述分离的PBMC按5×106个细胞中加入1 ml Trizol溶液，反复吹打使细胞彻底裂解。按1 ml Trizol加200 μl氯仿(5∶1)，剧烈震荡15 s，室温静置5 min，4℃离心(12 000 r/min，15 min)，小心吸取上清，按与上清1∶1的比例加入异丙醇(约450 μl)，上下颠倒混匀后，-20℃静置60 min，4℃离心(12 000 r/min，10 min)，仔细将液体倒掉，加入1 ml 75%的乙醇(DEPC水配制)，4℃离心(12 000 r/min，10 min)洗涤沉淀1次，加入适量DEPC处理水(20 μl)溶解RNA，测OD值定量，以A260/A280，A260/A230比值判断RNA样品质量，-70℃冰箱保存备用。
1.4.2 引物设计 根据GenBank人IL-23p19 cDNA序列设计引物，以β-actin作为内参照。引物序列由上海英俊生物技术有限公司合成。IL-23p19(328 bp)：上游引物(5′-CTGCTTGCAAAGGATCCACC-3′)，下游引物(5′-TTGAAGCGGAGAAGGAGACG-3′)。β-actin(600 bp)：上游引物(5′- CACACTGTGCCCATCTACGA-3′)，下游引物(5′-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3′)。
1.4.3 RT-PCR 选用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，按试剂盒说明书操作，通过预实验确定PCR反应条件和最适循环数，以保证PCR产物量与起始mRNA量呈线性相关。反应结束后取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析仪(江苏捷达科技发展有限公司)上观察拍照，分析电泳条带的光密度值，以β-actin 作内参照， 用相对光密度值代表mRNA的表达量。相对光密度值=(IL-23p19光密度值/β-actin光密度值)×100%。
1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)
采用双抗体夹心ABC-ELISA 法，人IL-23 ELISA 检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司(批号: SX01087)，操作过程均严格按试剂说明书操作。采用BIO-RAD伯乐酶标仪680于492 nm 波长处测定OD值，通过绘制标准曲线计算样本的浓度。
1.6 免疫比浊法
检测血清RF用OLYMPUS全自动生化分析仪(北京九强公司)，所用试剂为原装配套试剂，检测正常范围<14 IU/ml。
1.7 统计学分析
所有数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。数据用均数±标准差(x±s)表示， 两组间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。各指标间的相关性检验采用Pearson相关性分析。
2 结果
2.1 RA患者与健康对照者PBMC中IL-23p19 mRNA表达水平比较
RT-PCR电泳图中可见， 健康对照组和RA患者组在328 bp处都有条带出现，但在RA患者组的表达强度明显高于对照组(图1、表1)，说明RA患者PBMC中IL-23p19 mRNA的平均表达水平较健康对照组显著升高， 差异有统计学意义(P<0.05，表1)。
M：DNA Marker(DL1000)；1、2、3：正常对照组；4、5、6、7：RA病例组
M: DNA Marker (DL1000); 1, 2, 3: Healthy controls; 4, 5, 6, 7: RA patients
2.2 RA患者与健康对照者血清IL-23水平比较
RA患者血清中IL-23水平较健康对照组显著升高， 差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.3 RA患者IL-23与RF之间的相关性分析
RA患者血清IL-23含量与RF含量无明显相关性(r=0.389，P>0.05)。
3 讨论
类风湿关节炎是多因素自身免疫性疾病，其病因及发病机制仍不十分清楚，现在免疫机制越来越受到国内外专家的关注。RA患者体内多种细胞因子和炎症介质异常表达，它们之间通过相互作用、相互调节，形成一个复杂的网络，可能直接或间接参与RA的发生和发展过程[6]。IL-23是2000年报道的细胞因子，是由p19和IL-12p40共同形成的类似于IL-12p35p40的、由二硫键连接的异源二聚体可溶性复合物。其功能研究证明，p19单独不具有生物学活性，只有与p40共同构成p19p40时才有生物学活性。IL-23虽然与IL-12共有p40亚单位，但以其自身独特的亚单位p19与IL-12相区别。IL-23具有十分复杂的生物学功能，主要作用于记忆性CD4+T细胞，诱导Th1型细胞的分化及IFN-γ产生[7]，还可作用于记忆性Th17细胞亚群诱导产生IL-17，参与免疫炎症[8]。过去人们认为IL-12在自身免疫性炎症发挥中心作用，现在越来越多的研究表明在强直性脊柱炎(AS)、桥本甲状腺炎(HT)等患者体内IL-23的表达明显增高[9-10]，所以IL-23在这些自身免疫性疾病的发展过程中可能发挥着重要的作用。但目前对于IL-23在RA发病中的作用没有研究报道，本研究结果表明IL-23p19 mRNA和血清IL-23在RA组的表达水平都显著高于正常对照组，差异具有统计学意义，说明IL-23参与了RA的炎症过程，但具体作用机制有待进一步研究。
[参考文献]
[1] 潘晓夫,黄卓春,王兰兰.类风湿性关节炎疾病相关的特异性血清蛋白标志物[J].免疫学杂志,2009,25(5):563- 571.
[2] 王楷文,周成林,王胜军,等.Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎模型IL-25表达水平的变化及意义[J] ......
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